>1. Seeding für Expansionszellkulturen und CFU-Platten
- Resuspendieren Sie die Zellen (bestehend aus Erythrozyten und mononukleären Zellen) in 50 ml Basalmedium: Alpha-MEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2,5 mg/ml Amphotericin B. Zählen Sie die im Verhältnis 1:10 verdünnten Zellen in Trypanblau-Lösung unter Verwendung einer Neubauer-Kammer.
- Die Zellen werden in Zellkulturflaschen mit einer Dichte von 5 x 10⁷ Zellen/cm² plattiert und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C inkubiert. Falls verfügbar, hypoxische Bedingungen (5 % Sauerstoff) verwenden. Für die Kontrolle des CFU-Assays werden 10⁹ Zellen in einer Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 10 cm plattiert.
- Nach 3 Tagen Kultur werden mesenchymale Stammzellen an die Zellkulturschale gebunden, während andere Zellen in Suspension bleiben. Wechseln Sie das Medium durch Basalmedium, das mit 5 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) ergänzt wird. Für die Kontrolle des CFU-Assays behandeln Sie die Zellkulturschale ebenso.
- Setzen Sie die Zellkultur für insgesamt 2 Wochen fort und wechseln Sie dreimal pro Woche das Medium. Wenn die Zellen eine Konfluenz von mehr als 80 % erreichen, wird sie durch Trypsinisierung gespalten. Für die Kontrolle des CFU-Assays tauschen Sie die Medien ebenfalls aus, aber teilen Sie die Zellen im Laufe der zwei Wochen nicht.
2. Giemsa-Färbung für den CFU-Assay
- 10 ml Giemsa-Lösung pro Schale zubereiten: Die Stammlösung (7,6 g/l Giemsa in Glycerin:Methanol) 1:10 in sterilem Wasser verdünnen (immer eine frische Arbeitsverdünnung vorbereiten).
- Nehmen Sie das Medium aus der Zellkulturschale und waschen Sie die Zellen mit PBS. Seien Sie sehr vorsichtig, wenn Sie Flüssigkeit auf die Petrischale auftragen, und vermeiden Sie es, die Zellen abzuwaschen.
- Fixieren Sie die Zellen 5 Minuten lang in reinem Methanol bei RT. Entsorgen Sie das Methanol. Die Giemsa-Lösung zugeben und 60 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C inkubieren.
- Zweimal mit PBS waschen. Trocknen Sie den Teller mit dem Kopf voran an der Luft auf einem Papiertuch. Zählen Sie die Völker manuell. Dies gelingt am besten mit einem Markierungsstift auf der Rückseite der Platte.