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HINWEIS: Hundeknochenmarkaspirate aus dem Beckenkamm wurden mit Zustimmung des Hundebesitzers entnommen. Hundeknochenmarkaspirate (ca. 10 ml) wurden durch Zugabe von 15 ml 3,8%igem Natriumcitrat unmittelbar nach der Entnahme im Operationssaal antikoaguliert. Die Proben wurden noch am selben Tag, an dem sie entnommen wurden, zur Verarbeitung in die Laborumgebung überführt.
>1. Herstellung von Urokinase (vor der 1. Anwendung)
- Rekonstitution der Urokinase mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemäß den Anweisungen des Herstellers: Geben Sie 10 ml PBS mit einer 10-ml-Spritze in den Septum-Inlet-Kolben. Die Trockensubstanz durch Schwenken auflösen, um 50.000 Injektionseinheiten (U) pro ml zu erhalten.
- Bereiten Sie 500 μl Aliquots (je 25.000 U) in sterile Röhrchen vor. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C und verwenden Sie sie bei Bedarf mindestens 6 Monate.
>2. Präparative Schritte (vor jeder Knochenmarkbehandlung)
- Tauen Sie ein Aliquot der Urokinase (25.000 E) pro geronnenem Knochenmarkaspirat auf (Aspiratvolumina bis zu 25 ml wurden erfolgreich mit einem einzigen Aliquot von 25.000 U behandelt).
- Heizen Sie ein Wasserbad oder einen Schüttelinkubator auf 37 °C vor.
>3. Enzymatischer Verdau des Gerinnsels
- Führen Sie alle Arbeiten in einer Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank durch, um eine mikrobielle Kontamination der Knochenmarkproben während der Verarbeitung zu vermeiden. Bei der Arbeit mit potenziell infektiösem menschlichem Material wird die Verwendung von Schutzhandschuhen sowie eine vorsichtige Handhabung empfohlen.
- Legen Sie ein 100-μm-Zellsieb auf ein steriles 50-ml-Röhrchen. Gießen Sie das Knochenmarkaspirat vorsichtig durch das Zellsieb, kippen Sie das Sieb oder bewegen Sie es um das Gerinnselmaterial herum. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um den Durchfluss durch das Filtergewebe zu verbessern.
Anmerkung: Vermeiden Sie eine Verdünnung des Gerinnsels, z. B. durch Waschen des Gerinnsels mit PBS. Urokinase wirkt indirekt und benötigt Bestandteile des Serums (d. h. Plasminogen) aus der Biopsie für eine effektive Verdauung. Während das Verfahren mit dem Gerinnselmaterial fortgesetzt wird, kann das Filtrat bis zur weiteren Verwendung in Schritt 3.6 bei RT gehalten werden.
- Übertragen Sie das Knochenmarkgerinnselmaterial mit einer sterilen Pinzette in eine leere Zellkulturschale. Schneiden Sie die Rückstände mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke von ca. 2 mm3
.
- Übertragen Sie die kleinen Stücke des Gerinnsels mit der sterilen Pinzette in ein 50 ml Reaktionsröhrchen. Stellen Sie sicher, dass das gehackte Gerinnsel ein nasses Aussehen hat. Wenn es trocken zu sein scheint, verwenden Sie etwas von dem Filtrat aus Schritt 3.1 zum Befeuchten.
- Zerreiben Sie das Gerinnsel, indem Sie mit einer 5-ml-Mikrotiterpipette 5 Mal auf und ab pipettieren. Geben Sie 1 Aliquot Urokinase in die Probe. 30 min bei 37 °C entweder im Wasserbad oder in einem (sanft geschüttelten) Inkubator inkubieren.
- Zerreiben Sie, indem Sie mit einer 5-ml-Pipette 5 Mal auf und ab pipettieren. Führen Sie diesen Schritt in einer Biosicherheitswerkbank durch. Weitere 30 Minuten bei 37°C inkubieren. Nach der Inkubation erneut 5 Mal mit einer 5 ml Pipette verreiben. Über ein frisches 100-μm-Zellsieb wird das Filtrat aus Schritt 3.2 gepoolt.
- Die Zellsuspension wird bei Raumtemperatur 10 min lang bei 500 x g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem Medium wie unten beschrieben oder gemäß dem Standardverfahren Ihres Labors für die MSC-Expansionskultur.
>4. Seeding für Expansionszellkulturen und CFU-Platten
- Resuspendieren Sie die Zellen (bestehend aus Erythrozyten und mononukleären Zellen) in 50 ml Basalmedium: Alpha-MEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2,5 mg/ml Amphotericin B. Zählen Sie die im Verhältnis 1:10 verdünnten Zellen in Trypanblau-Lösung unter Verwendung einer Neubauer-Kammer.
- Die Zellen werden in Zellkulturflaschen mit einer Dichte von 5 x 107 Zellen/cm2 plattiert und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C inkubiert. Falls verfügbar, hypoxische Bedingungen (5 % Sauerstoff) verwenden. Für die Kontrolle des CFU-Assays werden 109 Zellen in eine Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 10 cm gegeben.
- Nach 3 Tagen Kultur werden mesenchymale Stammzellen an die Zellkulturschale gebunden, während andere Zellen in Suspension bleiben. Wechseln Sie das Medium durch Basalmedium, das mit 5 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) ergänzt wird. Für die Kontrolle des CFU-Assays behandeln Sie die Zellkulturschale ebenso.
- Setzen Sie die Zellkultur für insgesamt 2 Wochen fort und wechseln Sie dreimal pro Woche das Medium. Wenn die Zellen eine Konfluenz von mehr als 80 % erreichen, wird sie durch Trypsinisierung gespalten. Für die Kontrolle des CFU-Assays tauschen Sie die Medien ebenfalls aus, aber teilen Sie die Zellen im Laufe der zwei Wochen nicht.
>5. MSC-Unterscheidung
- Differenzierung von MSCs bei Hunden
Anmerkung: Die caninen MSCs wurden durch Stimulation mit den entsprechenden Medien für vier Wochen in chondrogene, osteogene und adipogene Linien differenziert.
- Chondrogene Differenzierung
- Schneiden Sie Würfel (3 mm pro Seite) aus einem schwammförmigen Medizinprodukt, das aus lyophilisiertem Kollagen Typ I besteht und als Gerüstmaterial zur Unterstützung der Zellen verwendet wird.
- MSCs auf der Oberseite der Würfel in einer Konzentration von 4 x 106 Zellen/ml (~70.000 Zellen/Würfel) aussäen.
- Lassen Sie die Zellen vor der Zugabe von Medien 30 Minuten lang an den Würfeln haften.
- Erhaltung von MSC-Kollagen-Konstrukten in chondrogenen Medien, bestehend aus DMEM/F12 + GlutaMAX, 2,5 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 2,5 μg/ml Amphotericin B, 40 ng/ml Dexamethason, 50 μg/ml Ascorbinsäure-2-phosphat, 50 μg/ml L-Prolin, 1x Insulin-Transferrin-Selen X und 10 ng/ml transformierender Wachstumsfaktor-β1.
- Verwenden Sie die Alcianblau-Färbung, um die Akkumulation von Proteoglykanen in Konstruktschnitten zu visualisieren. Kurz gesagt, färben Sie die Abschnitte O/N mit 0,4 % Alcianblau, gelöst in 0,01 %H2SO4 und 0,5 M Guanidinhydrochlorid. Als nächstes waschen Sie die Abschnitte 30 Minuten lang in 40 % DMSO und 0,05 M MgCl2. Die Zellen wurden mit nuclear fast red gegengefärbt.