Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Quantifizierung der Gewebefibrose
- Legen Sie das paraformaldehyd-fixierte Herzgewebe auf ein Gewebetrenngerät und schneiden Sie 2 mm dicke Schnitte. Legen Sie die Gewebeschnitte in eine Einbettkassette. Dehydrieren Sie das Gewebe durch eine Reihe von abgestuften Alkoholbädern (50%, 75%, 95% und 100% für jeweils 1 Stunde).
- Infiltrieren Sie das Gewebe 1 Stunde lang mit Xylol und schließlich 1 Stunde lang mit Wachs. Legen Sie das infiltrierte Gewebe in eine Einbettkassette und betten Sie es mit Paraffinwachs ein. Lagern Sie das eingebettete Gewebe in Paraffinblöcken bei Raumtemperatur bis zum Mikrotomieren.
- Schneiden Sie das eingebettete Gewebe in 4 μm dicke Abschnitte. Legen Sie die Abschnitte in ein 45 ºC heißes Wasserbad. Tauchen Sie einen Objektträger schräg in das Wasserbad und nähern Sie sich allmählich den Kanten des Paraffinabschnitts, um eine teilweise Befestigung am Objektträger zu ermöglichen.
- Bewegen Sie den Schieber in die Badewanne hinein und wieder heraus, um mögliche Lufteinschlüsse unter dem Gewebeschnitt zu entfernen und eine bessere Befestigung zu ermöglichen. Trocknen Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei 37 ºC und lagern Sie sie bei Raumtemperatur für die histologische Färbung.
- Setze die Rutsche in einen Tank ein. Entparaffinieren Sie den Objektträger 30 min lang mit Xylol und rehydrieren Sie ihn in nacheinander verdünntem Alkohol (95%, 75% und 50% für jeweils 3 min) und schließlich in destilliertem Wasser. Verwenden Sie eine geeignete picrosirius-rote Lösung, um die Gewebeschnitte 1 Stunde lang vollständig zu bedecken. Spülen Sie die Objektträger zweimal in einer 0,5%igen Essigsäurelösung und spülen Sie dann zweimal mit absolutem Alkohol.
- Trocknen Sie die Rutsche an der Luft und befestigen Sie sie mit einem Deckglas aus Kunstharz. Fotografieren Sie die Folie in einem sichtbaren Lichtfeld.
Anmerkung: Der rote Bereich auf dem Foto zeigt eine picrosiriusrote positive Zone unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Berechnen Sie den prozentualen Anteil der positiven Zone Picrosiriusrot über die Gesamtfläche, der das Ausmaß der Fibrose angibt.
