Sudan IV Färbung: Ein Verfahren zur Färbung von lipidbeladenen atherosklerotischen Plaques im entnommenen Aortenbogen der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Centa, M., et al. Quantifizierung der Atherosklerose bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt ein Verfahren mit Sudan IV-Färbung zur Färbung der Fettablagerungen im entnommenen Aortenbogen der Maus, um die atherosklerotischen Plaques sichtbar zu machen und das Ausmaß der Atherosklerose zu bestimmen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft

>1. de Gesichtsanalyse des Aortenbogens und der Arteria brachiocephalica

1. Vorbereitung von Pinning-Betten für die Gesichtsanalyse von Aortenbögen. Falten Sie ein Segment des Paraffinwachsfilms achtmal, um eine flache Oberfläche von 25 mm x 25 mm zu erhalten. Wickeln Sie es mit schwarzem Isolierband ein, um einen dunklen Hintergrund für die Aorta zu schaffen. Platzieren Sie ein Etikett auf der Rückseite des Steckbetts und schreiben Sie mit einem Bleistift die Mausidentifikationsnummer (normale Stifttinte verschwindet beim Färbevorgang).
2. Übertragen Sie den Aortenbogen auf das Stiftbett und geben Sie einen Tropfen PBS darauf. Beginnen Sie mit der Reinigung der Aorta von verbleibendem periadventtiellem Fettgewebe unter einem Stereomikroskop.
   1. Verwenden Sie eine Vannas-Schere und eine Dumont-Pinzette, um das gesamte umgebende Fettgewebe sanft abzuziehen, ohne die Aorta zu manipulieren oder zu beschädigen. Der Sudan IV färbt Fettgewebe hell ab und es ist entscheidend, dieses Gewebe zu diesem Zeitpunkt vollständig zu entfernen.
      Anmerkung: Halten Sie die Aorta immer feucht und wenden Sie bei Bedarf zusätzliches PBS an.
3. Schneiden Sie die Aorta in der koronalen Ebene auf, indem Sie die Vannas-Schere in das Aortenlumen einführen, um die Intimoberfläche freizulegen. Beginnen Sie, die äußere Krümmung des aufsteigenden Bogens in distaler Richtung zu durchtrennen und schneiden Sie weiterhin die Äste einschließlich der Arteria brachiocephalica auf. Schonen Sie den dorsalen Teil der absteigenden Brustregion.
   1. Schneiden Sie die kleinere Krümmung auf und klappen Sie die Aorta auf, um die innere Oberfläche zu zeigen.
      Anmerkung: Dieser Schritt erfordert feinmotorische Fähigkeiten und erfordert etwas Übung, um ihn zu meistern.
4. Stecken Sie den offenen Bogen mit dem stumpfen Ende der winzigen Insektennadeln an das Steckbett. Verwenden Sie einen Mikro-Castroviejo-Nadelhalter, um die Stifte an Ort und Stelle zu setzen. Biegen Sie die Stifte vorsichtig von der Probe weg, wenn sie an Ort und Stelle sind. Stecken Sie die Aorta flach auf das Bett, ohne die Probe zu dehnen. Lagern Sie den gepinnten Bogen nach unten in einer mit PBS gefüllten Petrischale bei 4 °C.
   Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
5. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung für Sudan IV vor. Mischen Sie 1 g Sudan IV Pulver, 100 ml 70% Ethanol und 100 ml Aceton in einer dunklen Flasche und rühren Sie 10 Minuten lang vorsichtig um. Es ist nicht erforderlich, die Lösung zu filtern, und sie kann einige Monate lang verwendet werden, wenn sie dunkel bei Raumtemperatur aufbewahrt wird. Wenn die Färbefarbe nicht zufriedenstellend ist, kann eine neue Lösung hergestellt und die Proben erneut angefärbt werden.
   Vorsicht: Aceton ist eine brennbare Flüssigkeit, die schwere Augenreizungen verursachen kann. An einem gut belüfteten Ort lagern und bei der Handhabung Vorsichtsmaßnahmen treffen.
6. Ordnen Sie fünf Petrischalen auf dem Labortisch an: eine mit 70 % Ethanol, eine mit Sudan IV-Arbeitslösung, zwei mit 80 % Ethanol gefüllt und eine mit PBS gefüllt.
   1. Beginnen Sie damit, die Probe 5 Minuten lang mit 70 % Ethanol zu spülen, indem Sie das Stiftbett mit dem Bogen nach unten in die erste Petrischale stellen. Übertragen Sie die Probe in die Sudan IV-Arbeitslösung und lassen Sie sie den Bogen 7 Minuten lang färben.
   2. Spülen Sie anschließend zweimal 3 Minuten lang mit 80 % Ethanol ab, um die normale Oberfläche zu entfärben. Die Entfärbungszeit kann angepasst werden, um die Ergebnisse zu optimieren. Spülen Sie zum Schluss in PBS, bevor Sie die Probe wieder in die ursprüngliche Petrischale geben.
7. Erfassen Sie Mikroskopaufnahmen mit einem Stereomikroskop mit 10-facher Vergrößerung, das an eine Digitalkamera angeschlossen ist. Machen Sie Fotos von dem in PBS eingetauchten Stiftbogen mit kleinen Metallgewichten (20 mm x 10 mm x 5 mm), um das Stiftbett am Boden einer Petrischale zu halten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Schwarzes Elektroisolierband (50 mm breit)	Jeder Fachhändler		Zur Erstellung von Stiftbetten für Aortenbögen.
Präparierschere (10 cm, gerade)	Welt Präzisionsinstrumente	Artikel-Nr.: 14393	Zur allgemeinen Dissektion von Organen.
Dumont Pinzette #5 (11 cm, gerade)	Welt Präzisionsinstrumente	500341	Zur Mikrodissektion der Aorta.
Ethanol 70% (v/v)	VWR Chemikalien	Artikel-Nr.: 83801.29	Flüssigkeit und Dampf leicht entzündlich, an einem gut belüfteten Ort lagern und kühl aufbewahren.
Ethanol absolut ≥99,8 %	VWR Chemikalien	Artikel-Nr.: 20821.31	Flüssigkeit und Dampf leicht entzündlich, an einem gut belüfteten Ort lagern und kühl aufbewahren.
Formaldehyd 4% stabilisiert, gepuffert (pH 7,0)	VWR Chemikalien	9713.1	Gesundheitsschädlich beim Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken.
Isopropanol	Merck	1096341011	Entzündbare Flüssigkeit, verursacht schwere Augenreizungen und kann Schläfrigkeit oder Schwindel verursachen.
Micro Castroviejo Nadelhalter (9 cm, gerade)	Welt Präzisionsinstrumente	503376	Zum Fixieren von Aortenbögen.
Minutien Insektenstifte, 0,10 mm	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 26002-10	Zum Fixieren von Aortenbögen.
Parafilm M	Bemis	PM992	Paraffinwachsfilm, der zur Herstellung von Stiftbetten für Aortenbögen verwendet wird.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	-	-	Für die Perfusion von Mäusen ist eine sterile und RNase-freie Lösung erforderlich
stereomikroskop	Leica Mikrosysteme	MZ6	Zum Präparieren und zur En-Face-Dokumentation
Sudan IV	Sigma-Aldrich	Nr. S4261	Nicht als gefährlicher Stoff oder Gemisch eingestuft.
Vannas Schere (8 cm, gerade)	Welt Präzisionsinstrumente	503378	Zur Mikrodissektion der Aorta.

kg