Maule-Färbung für Lignin: Eine Technik zur Charakterisierung der Ligninverteilung in Stammschnitten von Arabidopsis thaliana

Zusammenfassung

Quelle: Pradhan Mitra, P. et al., Histochemische Färbung von sekundären Zellwandelementen von Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2014).

In diesem Video beschreiben wir die Maule-Färbetechnik zur Färbung von Syringyllignin, das in den spezialisierten Pflanzenzellen vorhanden ist. Diese Färbetechnik hilft bei der Charakterisierung der Ligninverteilung im Xylem und in den interfaszikulären Fasern.

Protokoll

1. Mäule-Färbung

1. 0,2 g Kaliumpermanganat in 40 ml destilliertem Wasser auflösen, um eine 0,5%ige Kaliumpermanganatlösung herzustellen. In einer dunklen Flasche bei Raumtemperatur maximal 7 Tage lagern.
   1. Bereiten Sie eine 3,7%ige HCl-Lösung vor, indem Sie 1 ml konzentriertes HCl (37 N) zu 9 ml destilliertem Wasser (1:10) hinzufügen. Bereiten Sie am Tag des Versuchs eine frische 3,7%ige HCl-Lösung vor. Es ist darauf zu achten, dass die verwendete 37 N HCl-Stammlösung nicht zu alt ist. Konzentrierte Ammoniumhydroxidlösung (14,8 M) sollte bei 4 °C gelagert werden, um eine Abnahme der Molarität der gesättigten Lösung zu verhindern.
2. Übertragen Sie die Stielabschnitte in ein 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 1 ml der 0,5%igen Kaliumpermanganatlösung in das Röhrchen mit den Abschnitten.
   1. Pipettieren Sie die 0,5%ige Kaliumpermanganatlösung vorsichtig auf und ab, vorzugsweise ohne die Schnitte zu stören. 2 Minuten inkubieren und das Pipettieren wiederholen. Lassen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen stehen, bis sich alle Abschnitte beruhigt haben.
      Anmerkung: Achten Sie darauf, die Schnitte nicht in die Pipettenspitze zu pipettieren, da die Schnitte beschädigt werden können. Es kann schwierig sein, die Stielabschnitte zu sehen, da die Lösung dunkel ist, also bewahren Sie das Röhrchen mit den Abschnitten auf dem Reagenzglasgestell auf und lassen Sie sie 2 Minuten lang einwirken.
   2. Mit einer 1-ml-Pipette 700 μl 0,5%ige Kaliumpermanganatlösung herausziehen. Fügen Sie 700 μl destilliertes Wasser hinzu, um die Kaliumpermanganatlösung auszuspülen. Wiederholen Sie den Vorgang 3-4x oder bis die Wasserlösung klar bleibt.
   3. Entsorge das Wasser. Fügen Sie schnell 1 ml 3% HCl hinzu, bis die tiefbraune Farbe aus den Abschnitten austritt. Dies kann innerhalb von 3-5 Minuten passieren oder 2 Wäschen à 5 Minuten erfordern. Pipettieren Sie die gesamte 3%ige HCl-Lösung aus und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
   4. 1 ml konzentrierte Ammoniumhydroxidlösung hinzufügen. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, wobei die Spitze so geschnitten ist, dass die Schnitte leicht und ohne Beschädigung herauspipettiert werden können. Pipettieren Sie die Schnitte vorsichtig in die Spitze und auf einen Objektträger. Decken Sie die Abschnitte mit einem Deckglas ab. Beobachten Sie die Abschnitte unter Hellfeldbeleuchtung. (Abbildung 1)
      Vorsicht: Da Ammoniumhydroxid extrem korrosiv ist, erfordert es besondere Sorgfalt und Aufmerksamkeit, um Korrosion am Tisch des Mikroskops oder der Linse zu vermeiden.
      Anmerkung: Die Ammoniumhydroxiddämpfe können das Deckglas beschlagen, was die Beobachtung der Probe erschwert. Seien Sie daher besonders vorsichtig, bevor Sie das Deckglas anbringen. Die Lösung trocknet in 5-10 Minuten aus, so dass die Bildgebung innerhalb dieses Zeitraums abgeschlossen werden muss.

Ergebnisse

Abbildung 1. Mäule-Färbung von Querschnitten des A. thaliana-Stammes. Mäule-Färbung (rote Farbe) eines Wildtyp-Stammschnitts von A. thaliana, der die normale Ligninablagerung in den Wänden von interfaszikulären Fasern und Xylemzellen (A-E) zeigt. Angegeben sind die Positionen der Epidermis und des Kortex (Ep), der interfaszikulären Fasern (Fi), des Marks (Pi) und des Xylems (Xy). Vergrößerungen: Panel A: 5X; Tafel B: 10X; Tafel C...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	EMD	MERC2125	CAS-Nummer: 9012-36-6
Salzsäure	EMD	Nr. HX0603-75	CAS-Nummer: 7647-01-0
Vibratom	Leica	Leica Mikrotom mit vibrierender Klinge VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ Produkte/Schneiden/Vibrationsklingen-Mikrotome/Details/Produkt/ LEICA-VT1000-S/
Rasierer	Amerikanisches Unternehmen für Rasierhobel	Artikel # 60-0139-0000	Doppelschneidige Klinge aus Edelstahl (Personna Super)
Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (2 ml)	VWR	Artikel-Nr.: 16466-044
Mikrozentrifugenröhrchen (0,6 ml)	Axygen Scientific	MCT-060-C
Gewebe-Kleber	Ted Pella Inc	Nr. 10033	Bei 4 °C oder 20 °C für 3 Monate oder länger lagern
Kamera mit CCD-Chip ohne mechanischen Verschluss	Hamamatsu	Nr. C4742-95
Kamera-Software	Molekulare Bauelemente	MetaMorph Version 7.7.0.0
Imaginäre Analyse	Lehmziegel	Photoshop CS4
Micro Cover Brille, quadratisch, Nr. 1	VWR	Artikel-Nr.: 48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8") )-Deckgläser sind korrosionsbeständig
Mikro-Objektträger mattiert, 1 mm	VWR	Artikel-Nr.: 48312-003	75 x 25 mm - 1 mm
Ammoniakwasser	EMD	AX1303-6	CAS-Nummer: 1336-21-6
Kaliumpermanganat	Sigma	223468	CAS-Nummer 7722-64-7