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>1. Einbettung des Stammes
- Stellen Sie eine 7%ige Agaroselösung in Wasser her (7 g Agarose in Elektrophoresequalität in 100 ml destilliertem Wasser). Lösen Sie die Agarose auf, indem Sie sie 20 Minuten lang autoklavieren oder 20 Minuten lang in der Mikrowelle bei niedrigster Intensität erhitzen (z. B. 10 % Intensität einer 1.250-Watt-Mikrowelle
).
- Bereiten Sie eine selbstgemachte Form zum Einbetten der Stiele mit Plastikfläschchen vor.
- Schneiden Sie mit einer Rasierklinge den konischen Boden eines 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens mit Schraubverschluss (Teil A) ab. Stechen Sie mit einer Spritzennadel ein Loch in den Röhrchendeckel, das etwas größer ist als der Durchmesser des einzubettenden Stiels. Schneiden Sie anschließend 0,5 cm vom Boden eines 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchens ab (Teil B).
- Geben Sie den abgeschnittenen 0,5 cm großen Teil des 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchens in das vorgeschnittene 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Versiegeln Sie die beiden Teile mit Parafilm (Abbildung 1).
HINWEIS: Der Boden des Röhrchens ist abgeschnitten, um die Entnahme der eingebetteten Probe nach dem Erstarren der Agarose zu erleichtern. Das Loch in der Kappe hilft dabei, den Stiel stabil zu halten, wenn der Stiel in Agarose eingebettet ist. Die Form dient dazu, die Agarose zu halten und den Stiel beim Einbetten gerade zu halten. Der Parafilm hält die beiden Teile, A und B, bis die Agarose ausgehärtet und der Stiel eingebettet ist.
- Schneiden Sie mit einer Rasierklinge einen Stängelabschnitt aus dem interessierenden Bereich ab (z. B. in der Mitte des ersten Stängel-Internodien).
HINWEIS: Idealerweise sollte der Stiel erst kurz vor dem Einbetten abgeschnitten werden, um eine Zerstörung durch Austrocknung zu vermeiden. Alternativ kann der Stiel in einer Platte mit einem mit Wasser benetzten Filterpapier zwischengelagert werden. Diese Platte kann bis zum Einbetten auf Eis gelegt werden, um eine Austrocknung und Verformung des Gewebes zu verhindern. Wenn Sie den Stiel länger als 30 Minuten ohne hohe Feuchtigkeit lagern, trocknet der Stiel aus.
- Die Agarose in der Mikrowelle bei niedriger Intensität schmelzen.
ACHTUNG: Die Flasche mit Agarose kann heiß sein. Verwende einen Handschuh, um die Flasche aufzuheben. Lassen Sie die geschmolzene Agarose bei Raumtemperatur (zwischen 20 °C und 25 °C) stehen, bis sie auf etwa 50 °C abgekühlt ist.
- Pipettieren Sie langsam 5 ml der Agarose in die vorgefertigte Kunststoffform, um das Fläschchen zu füllen
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in den Formen befinden. Luftblasen verursachen Lücken in der Agaroseform und bedecken die Stielprobe nicht vollständig, was schließlich zu einem ungleichmäßigen Schneiden der Probenabschnitte führt.
- Die Agarose 30 bis 60 Sekunden abkühlen lassen, bis sie halbfest wird. Mit einem kleinen Zahnstocher testen und darauf achten, dass er in die Agarose eindringen und aufstehen, aber nicht schwimmen kann.
HINWEIS: Wenn der Stiel platziert wird, während die Agarose noch heiß ist, schädigt er die Probe, indem er den Stiel schrumpft und die Zellmorphologie zerstört.
- Legen Sie den Stiel in dieses mit Agarose gefüllte Fläschchen. Achte darauf, dass der Vorbau gerade bleibt. Setze die perforierte Kappe so ein, dass die Spitze des Stiels von der Kappe gehalten wird. Drehen Sie die Schraubkappe nicht. Manchmal kann mehr als ein Stiel (einer einzigen Art) in ein einziges Fläschchen eingebettet werden; Verwenden Sie in diesem speziellen Fall jedoch nicht die Kappe.
HINWEIS: Wenn die Schraubkappe gedreht wird, verdreht sich der Stiel.
- Lassen Sie das Fläschchen 10-30 Minuten bei Raumtemperatur oder bei 4 °C stehen, bis es fest wird.
- Entferne die Form, indem du sie vorsichtig aus der Tube schiebst. Öffnen Sie den Parafilm. Drücken Sie mit dem Daumen vorsichtig mit dem Daumen auf den Boden von Teil B der Form, um die erstarrte Agarose aus Teil A auf einen Objektträger aus Glas zu lösen.
- Schneiden Sie den in Agarose eingebetteten Stiel in drei etwa gleich große Stücke von 1,2 cm Länge. Schneiden Sie den Teil des Stiels aus, der nicht in der Agarose war, und entsorgen Sie ihn.
- Lagern Sie diese Agarosestücke mit den eingebetteten Stielen in luftdichten 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in einer dunklen Box bei 4 °C, bis sie geschnitten werden können. Alternativ können die Tuben maximal eine Woche bei 4 °C gelagert werden.
HINWEIS: Eine Lagerung ist möglich, aber der Experimentator muss sich darüber im Klaren sein, dass die eingebetteten Stämme noch am Leben sind und je nach Experiment möglicherweise Artefakte eingeführt werden können.
>2. Einteilung des Vorbaus
VORSICHT: Lesen Sie das Vibratomen-Handbuch sorgfältig durch und befolgen Sie alle Sicherheitshinweise.
- Stellen Sie sicher, dass die Probenscheibe sauber und vollständig trocken (frei von Feststoffen oder Flüssigkeiten) ist. Reinigen Sie die Probenscheibe mit einer Rasierklinge, um Klebstoffreste von früheren Versuchen zu entfernen, und waschen Sie sie mit Wasser. Anschließend mit einem Papiertuch trocknen.
HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass der Klebstoff gut funktioniert und sich an die Agarose-Probe bindet. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß ausgeführt wird, ist es möglich, dass die Probe nicht an der Scheibe haftet und später dazu führt, dass die Probe während des Schneidens von der Scheibe fällt.
- Verwenden Sie weiche Papiertücher, um Feuchtigkeit aus dem Agaroseblock zu entfernen, der die Proben enthält.
- Geben Sie einen kleinen Tropfen Gewebekleber auf die Probenscheibe und streichen Sie den Kleber mit der Spitze der Klebeflasche so aus, dass der Bereich in der Mitte der Platte bedeckt ist. Platzieren Sie den Agaroseblock schnell so, dass die Proben für Quer- bzw. Längsquerschnitte entweder senkrecht oder parallel zur Platte stehen. Lassen Sie den Klebstoff die Probe bei Raumtemperatur oder bei 4 °C 10-30 Min. auf der Probenscheibe fixieren
HINWEIS: Dies ist ein zeitkritischer Schritt.
- Befestigen Sie die Probenscheibe auf der Pufferschale oder der Wanne. Der/die Agaroseblock(en) mit den Abschnitten sollten parallel zur Rasierklinge sein. Füllen Sie die Pufferschale mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur, bis die Proben vollständig untergetaucht sind.
- Schneide eine Rasierklinge in zwei Hälften und schneide dann die Enden mit einer stabilen Schere ab, sodass die Klinge völlig flach bleibt. Befestigen Sie eine Hälfte der vorgestanzten Rasierklinge am Messerhalter.
- Stellen Sie den Winkel am Messerhalter auf 84°, die Geschwindigkeit auf 0,90 mm/sec (Position 8 am Vibratom) und die Frequenz auf 50 Hz (Position 5 am Vibratom) ein. Schneiden Sie Abschnitte mit einer Dicke von 100 μm. Verwenden Sie den kontinuierlichen Modus.
HINWEIS: Diese Dicke wurde gewählt, um sicherzustellen, dass das Gewebe den verschiedenen Säure- und Basenbehandlungen standhält, die in einigen der Färbeprotokolle verwendet werden. Stellen Sie das Zeitfenster für das Schneiden ein und lassen Sie 15-20 Minuten im kontinuierlichen Modus ein, damit das Vibratom einen Agaroseblock von ca. 1,2 cm durchtrennen kann.
- Entnehmen Sie die Schnitte mit einer Einweg-Plastikpipette während des Schneidens in der Pufferschale. Alternativ können die Sektionen aus der Pufferschale in ein Becherglas und dann auf eine durchsichtige Petriplatte umgefüllt werden. Übertragen Sie einige Abschnitte in die 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Die Proben werden von einer Petriplatte entnommen, da die Schnitte auf einem klaren Hintergrund besser zu erkennen sind und die Pufferschale für die nächste Probe vorbereitet werden kann.
- Die Schnitte können in einem 50-ml-Röhrchen gelagert oder gesammelt und in 1,5 bis 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 °C für 30 bis 60 min gelagert werden
HINWEIS: Das Speichern der Abschnitte über einen längeren Zeitraum führt zu einer schlechten Bildqualität.
>3. Weißfärbung von Calcofluor
- 0,02 g fluoreszierender Aufheller 28 (Calcofluorweiß M2R) in 10 ml destilliertem Wasser auflösen, um eine 0,2%ige Stammlösung herzustellen. Die 0,2%ige Lösung kann sechs Monate in einer dunklen Flasche bei 4 °C gelagert werden. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von 0,02 % vor, indem Sie die 0,2 %ige Stammlösung 10x mit destilliertem Wasser verdünnen.
- Übertragen Sie die Stielabschnitte in ein 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. In das Röhrchen 1 ml der 0,02%igen Calcofluorweiß-Lösung geben. Pipettieren Sie die 0,02%ige weiße Calcofluor-Lösung vorsichtig auf und ab.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Schnitte nicht in die Pipettenspitze zu pipettieren, da dies die Schnitte beschädigen kann.
- 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und das Pipettieren wiederholen. Inkubieren Sie den Abschnitt weitere 3 Minuten bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Lassen Sie die Abschnitte auf dem Boden des Röhrchens absetzen, um das Pipettieren der Lösung zu erleichtern, ohne die Abschnitte zu beschädigen.
- Mit einer 1-ml-Pipette 700 μl 0,02 %ige Calcofluorweißlösung herausziehen und 700 μl destilliertes Wasser hinzufügen; warten Sie 5 Minuten, um die weiße Calcofluor-Lösung auszuspülen. Wiederholen Sie die Wäsche 3-4x. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, wobei die Pipettenspitze so geschnitten ist, dass die Schnitte leicht und ohne Beschädigung herauspipettiert werden können.
- Pipettieren Sie die Schnitte vorsichtig in die Spitze und auf einen Objektträger und decken Sie sie mit einem Deckglas ab. Beobachten Sie die Abschnitte unter UV-Licht.
