Polyacrylamid-Gelelektrophorese: Eine analytische Technik zum Nachweis von Heparansulfaten unterschiedlicher Kettenlängen, die aus Lungengewebe von Mäusen isoliert wurden

Zusammenfassung

Quelle: LaRiviere, W. B. et al., Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt das Trennverfahren von Heparansulfaten, die aus Lungengewebe von Mäusen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert wurden.

Protokoll

>1. Polyacrylamid-Gelelektrophorese von isolierten und gereinigten Glykosaminoglykanen

1. Bereiten Sie die für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) erforderlichen Lösungen im Voraus vor (Tabelle 1).
   Anmerkung: Wählen Sie den prozentualen Anteil des Acrylamids der auflösenden Gellösung in Abhängigkeit von der Größe der Glykosaminoglykane, die in der Probe erwartet werden. 15 % werden für die Auflösung größerer Fragmente (mehr als 30 Disaccharid-Untereinheiten Länge) empfohlen; 22 % für kleinere Fragmente (<20 Disaccharid-Untereinheiten lang).
2. Setzen Sie die leere Kassette in den PAGE-Tank ein. Gießen Sie das auflösende Gel wie folgt: Mischen Sie in einem 15-ml-Röhrchen 10 mL Lösungslösung, 60 μl 10 % Ammoniumpersulfat (muss frisch zubereitet werden) und 10 μl TEMED (fügen Sie TEMED zuletzt hinzu). Drehen Sie das Rohr vorsichtig 2-3x um. Verwenden Sie eine Pipette, um die oben genannte 10-ml-Lösung schnell in die Kassette zu geben. Mit 2 mL deionisiertem, gefiltertem Wasser überlagern und das auflösende Gel 30 Minuten lang polymerisieren lassen
   Anmerkung: Das folgende PAGE-Protokoll wurde für ein vertikales PAGE-System optimiert, das 13,3 x 8,7 cm (Breite x Länge) und 1,0 mm dicke Gießkassetten mit einem Gesamtvolumen von ca. 12 ml verwendet. Andere Kassettensysteme können verwendet werden, erfordern jedoch möglicherweise eine Optimierung durch den Endbenutzer.
3. Nachdem das Auflösungsgel vollständig polymerisiert ist, entsorgen Sie das überlagerte Wasser und gießen Sie das Stapelgel wie folgt: Mischen Sie in einem 15-ml-Röhrchen 3 mL der Stapelgellösung, 90 μl 10% Ammoniumpersulfat (muss frisch zubereitet werden), 3 μl TEMED (fügen Sie TEMED zuletzt hinzu).
4. Drehen Sie das Rohr vorsichtig 2-3x um. Verwenden Sie eine Pipette, um die Stapelgellösung schnell über das verfestigte Auflösungsgel zu geben. Kassette bis zum Rand füllen. Vollständig einsetzen Kamm, der im Lieferumfang des Setups enthalten ist. Lassen Sie das Stapelgel 30 min polymerisieren.
5. Sobald das Gel polymerisiert ist, stellen Sie sicher, dass der Klebebandstreifen von der Unterseite der Kassette entfernt wird, und setzen Sie die Kassette wieder in die PAGE-Tankbaugruppe ein.
6. Füllen Sie die obere und untere Kammer mit dem Puffer der oberen bzw. unteren Kammer.
7. Die getrockneten Proben aus Schritt 1.11.4 werden in dem minimal erforderlichen Volumen an entionisiertem, gefiltertem Wasser (höchstens 50 % des Volumens der Vertiefungen im PAGE-Gel) gelöst. 1:1 mit Probenladepuffer mischen. Laden Sie die Proben und die HS-Oligosaccharid-"Leitern" (siehe Tabelle 1) in das Gel.
8. Lassen Sie das Gel 5 Minuten lang bei 100 V vorlaufen. Lassen Sie das Gel dann 20-25 min lang bei 200 V laufen (für ein 15%iges Polyacrylamid-Lösungsgel), 40-50 min (für ein 18%iges Polyacrylamid-Lösungsgel), 90-100 min (für ein 22%iges Polyacrylamid-Lösungsgel).
   Anmerkung: Möglicherweise ist eine Optimierung der 200 V Laufzeit erforderlich. Phenolrot wandert vor Heparin-Oligosacchariden, die 2 Polymeruntereinheiten lang sind (d. h. Polymerisationsgrad 2 oder dp2); Bromphenolblau wandert vor DP10-DP14. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Spannung so angelegt wird, dass die phenolrote Bande fast, aber nicht ganz, an den Boden des Gels wandert. Passen Sie die Laufzeit entsprechend an.

Ergebnisse

Tabelle 1: Erforderliche Lösungen für die Elektrophorese von Polyacrylamid-Gelphoresen von gereinigten Glykosaminoglykanen. Alle Lösungen müssen vor der Verwendung filtriert werden (0,22 μm).

...

HINWEIS: Alle Lösungen müssen vor der Verwendung gefiltert werden (0,22μm).
Lösung	Rezept

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ammoniumpersulfat (fest)	ThermoFisher Scientific	Nr. BP179-25	Elektrophorese-Qualität
Barnstead GenPure Pro Wasseraufbereitungssystem	ThermoFisher Scientific	10-451-217 PKG	Jedes Wasserentionisierungs-/Reinigungssystem ist ein akzeptabler Ersatz
Borsäure (fest)	ThermoFisher Scientific	Nr. A73-500	Molekularbiologie
Bromphenolblau (massiv)	ThermoFisher Scientific	Nr. B392-5
Criterion leere Kassette für PAGE (1,0 mm dick, 12+2 Wells)	Bio-Rad	3459901	Jedes 1,0 mm dicke PAGE-Casting-Kassettensystem reicht aus
Criterion PAGE Zellensystem (Zelle und Netzteil)	Bio-Rad	1656019	Jedes vergleichbare vertikale Gel-PAGE-System funktioniert)
EDTA-Dinatriumsalz (fest)	ThermoFisher Scientific	Tel.: 02-002-786	Molekularbiologie
Glycin (fest)	ThermoFisher Scientific	G48-500	Elektrophorese-Qualität
Salzsäure (flüssig)	ThermoFisher Scientific	Nr. A466-250
N,N'-Methylen-bis-acrylamid (fest)	ThermoFisher Scientific	Nr. BP171-25	Elektrophorese-Qualität
Phenolrot (fest)	ThermoFisher Scientific	Seite 74-10	Freie Säure
Saccharose (fest)	ThermoFisher Scientific	Nr. BP220-1	Molekularbiologie
TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylendiamin)	ThermoFisher Scientific	BP150-20	Elektrophorese-Qualität
Tris-Basis (massiv)	ThermoFisher Scientific	Nr. BP152-500	Molekularbiologie
Vakuumfiltereinheit, Einmalgebrauch, 0,22 μM PES, 500 μl Volumen	ThermoFisher Scientific	Tel.: 569-0020	Alternative Volumina und Filtermaterialien akzeptabel
Acrylamid (fest)	ThermoFisher Scientific	Nr. BP170-100	Elektrophorese-Qualität
Vom Heparin abgeleitetes Dekasaccharid (dp10)	Galen wissenschaftlich	HO10
Heparin-abgeleitetes Hexasacchard (dp6)	Galen wissenschaftlich	HO06
Heparin-abgeleitetes Oligosaccharid (dp20)	Galen wissenschaftlich	HO20