Denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die RNA-Analyse: Eine Technik zur Trennung von fluoreszenzmarkierten phosphorylierten RNA-Oligonukleotiden von ihren nicht-phosphorylierten Äquivalenten

Zusammenfassung

Quelle: Pillon, M. C., et al., Nichtradioaktiver Assay zur Messung der Polynukleotidphosphorylierung von kleinen Nukleotidsubstraten. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir eine denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Trennung von phosphorylierten RNA-Spezies von ihren nicht-phosphorylierten Gegenstücken. Die RNA-Spezies werden für die Laserdetektion auf dem Gel fluoreszenzmarkiert.

Protokoll

>1. Gel-Elektrophorese

1. Bereiten Sie eine 15%ige Acrylamid/8 M Harnstoffgellösung vor.
   Vorsicht: Acrylamid muss mit Vorsicht gehandhabt werden, da es sich um ein Neurotoxin handelt. Tragen Sie beim Umgang immer Handschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille.
   1. In einem 150-ml-Becherglas werden 22,5 ml vorgemischte 40%ige Acrylamid/Bis-Acrylamid-Lösung 29:1, 6 ml 10x FSME, 28,8 g Harnstoff und RNasefreies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 59 ml kombiniert. Rühren Sie die Lösung vorsichtig um.
      Anmerkung: Abhängig von der Länge des RNA-Substrats kann eine Änderung des Polyacrylamid-Anteils die Auflösung zwischen unphosphorylierter und phosphorylierter RNA verbessern.
   2. Um den Harnstoff aufzulösen, erhitzen Sie die Lösung 20 s lang in der Mikrowelle, rühren Sie die Flüssigkeit um und stellen Sie die Lösung sofort wieder für weitere 20 s in die Mikrowelle. Rühren Sie die Lösung vorsichtig um, bis sich der Harnstoff vollständig aufgelöst hat.
   3. Kühlen Sie die Lösung langsam ab, indem Sie das Becherglas in ein flaches Wasserbad mit kaltem Wasser stellen. Stellen Sie sicher, dass der Gehalt an kaltem Wasser um das Glasbecherglas herum über dem Niveau der Lösung im Glasbecher liegt. Dies wird eine effiziente Wärmeübertragung fördern. Warten Sie 5 Min.
      Anmerkung: Fahren Sie mit diesem Protokoll nicht fort, wenn sich der Becherglas warm anfühlt; Das Wasser sollte unter 25 °C heiß sein. Wenn es sich nach 5 min immer noch warm anfühlt, dann ersetzen Sie das Wasser im Wasserbad durch frisches kaltes Wasser und warten Sie weitere 5 min.
   4. Filtrieren und entgasen Sie die Lösung mit einer 0,22-μm-Einwegfiltrationseinheit, um Partikel und mikroskopisch kleine Luftblasen zu entfernen.
2. Gießen Sie das Denaturierungsgel ein
   1. Verwenden Sie Seife und warmes Wasser, um eine kurze und lange Glasplatte für Gele mit den Gesamtmaßen 31,0 cm x 38,5 cm zu reinigen. Besprühen Sie jede Glasplatte mit 95%igem Ethanol und wischen Sie das Glas ab, um jegliche Feuchtigkeit zu entfernen.
      Anmerkung: Eine der beiden Platten kann silikonisiert werden, um eine Beschädigung des Gels beim Trennen des Glasplattensandwiches zu vermeiden. Dieser Schritt ist jedoch nicht notwendig, da dieses Protokoll darauf ausgelegt ist, die RNA sichtbar zu machen, ohne die Glasplatten zu trennen.
   2. Platzieren Sie die lange Glasplatte waagerecht auf einer Box, so dass sie von der Arbeitsplatte abgehoben ist.
      Vorsicht: Acrylamid ist giftig, daher muss die Gelausgießstation mit Bankpapier bedeckt sein, das verschüttete Flüssigkeit aufnehmen kann, und sofort nach Abschluss des Verfahrens in einen Abfallbeutel gelegt werden.
   3. Platzieren Sie einen sauberen 0,4 mm Abstandshalter entlang der langen Kanten der langen Glasplatte.
   4. Legen Sie die kurze Glasplatte auf die lange Platte und stellen Sie sicher, dass die Kanten der kurzen Platte, der langen Platte und der Abstandshalter ausgerichtet sind. Klemmen Sie jede Seite mit drei gleichmäßig verteilten Metallklammern.
   5. 24 μl TEMED zu der in Schritt 3.1 hergestellten 15%igen Acrylamid/8 M Harnstofflösung geben und die Lösung mischen.
   6. Geben Sie 600 μl 10 % (w/v) APS in Schritt 1.2.5 in die Lösung und mischen Sie die Lösung vorsichtig.
   7. Gießen Sie die Lösung sofort zwischen die Glasplatten.
      Anmerkung: Um Blasen zu vermeiden, klopfen Sie beim Eingießen der Lösung auf das Glas.
   8. Legen Sie vorsichtig einen sauberen, 0,4 mm großen, 32-Well-Kamm auf die Oberseite des Glasplattensandwiches.
   9. Warten Sie mindestens 30 Minuten, bis das Acrylamid polymerisiert ist.
3. Lassen Sie das Denaturierungsgel laufen
   1. Stellen Sie den Heizblock auf 75 °C ein.
   2. Entfernen Sie die Metallklammern, mit denen das Glasplattensandwich zusammengehalten ist, und waschen und trocknen Sie das Glasplattensandwich gründlich.
   3. Legen Sie das Glasplattensandwich mit der kurzen Platte nach innen in das Gelgerät.
   4. Bereiten Sie 0,5x FSME-Laufpuffer vor, indem Sie 100 mL 10x FSME mit 1,9 l RNase-freiem Wasser kombinieren. Geben Sie 600 ml des Laufpuffers in die obere und untere Kammer des Gelgeräts.
   5. Entfernen Sie vorsichtig den Kamm und spülen Sie die Vertiefungen gründlich mit einer Spritze aus. HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für die Entfernung von Harnstoff aus den Vertiefungen.
   6. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 50 W vorlaufen. Die Spannung beträgt ca. 2.000 V. VORSICHT: Dieses Gelgerät arbeitet mit einer hohen Wattzahl und Benutzer sollten Vorsicht walten lassen.
   7. Spülen Sie die Vertiefungen gründlich mit einer Spritze aus.
      Anmerkung: Dieser Schritt ist entscheidend für eine gleichmäßige Beladung der Probe in die Vertiefungen.
   8. Puls spin die gequenchten Reaktionen. Anschließend die Röhrchen bei 75 °C 3 min inkubieren. Wiederholen Sie die Impulsdrehung.
   9. Laden Sie sofort 10 μl Probe pro Vertiefung und lassen Sie das Gel 3 Stunden lang bei 50 W.
      laufen Anmerkung: Fluoreszenzmarkierte RNA ist lichtempfindlich; Decken Sie daher das Gelgerät mit Folie ab.
4. Stellen Sie sich das Denaturierungsgel vor.
   1. Schalten Sie die Stromversorgung aus und entleeren Sie die obere Kammer des Gelgeräts.
   2. Waschen und trocknen Sie die Außenseite des Glasplattensandwiches mit Wasser und Seife. Decken Sie das Glasplattensandwich mit Folie ab, während Sie das Gel transportieren.
   3. Montieren Sie das Glasplattensandwich auf dem Tisch eines Laserscanners, der in der Lage ist, quantitative und empfindliche Fluoreszenzdetektion durchzuführen.
      Anmerkung: Dieses Gel ist extrem dünn für maximale Auflösung. Aus diesem Grund ist dieses Protokoll so konzipiert, dass die Schwierigkeiten beim Entfernen des Gels aus dem Glasplattensandwich vermieden werden, indem die fluoreszenzmarkierte RNA direkt durch die Glasplatten sichtbar gemacht wird. Die Verwendung von kommerziell erhältlichen Glasplatten mit niedriger Fluoreszenz erhöht das erfasste Signal, indem das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert wird.
   4. Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen des Laserscanners für das gewünschte Fluorophor ein.
      Anmerkung: Die optimalen Anregungs- und Emissionswellenlängen können für bestimmte Fluorophore unterschiedlich sein. Für das FAM-Fluorophor betragen die Anregungs- und Emissionswellenlängen 495 nm bzw. 535 nm.
   5. Definieren Sie den zu visualisierenden Bereich auf dem Laserscanner-Tisch und bilden Sie das Gel gemäß den Herstellerangaben ab (Abbildung 1).

Ergebnisse

Abbildung 1: Beispiel für eine denaturierende Gelanalyse von phosphorylierter RNA. In vitro RNA-Kinase-Assay von Las1-Grc3 (110 nM), inkubiert mit 500 nM SC-ITS2 RNA. X markiert die Kontrollreaktion ohne Las1-Grc3 und das schwarze Dreieck stellt die Titration von ATP von 0-10 mM dar...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,4 mm 34-Well-Kamm	BioRad	1653848
0,4 mm Abstandshalter	BioRad	1653812
0,5 M EDTA ph 8,0	KD Medizin	RGF-3130
1M Magnesiumchlorid	KD Medizin	CAC-5290
1M Tris pH 8,0	KD Medizin	RGF-3360
40% Acrylamid/Bis-Lösung 29:1	BioRad	1610146
5M Natriumchlorid	KD Medizin	RGF-3720
Ammoniumpersulfat (APS)	BioRad	Tel.: 161-0700
Atp	Sigma	Nr. A2383-1G
Borsäure	Sigma	Nr. B0394
Bromphenolblau-Natriumsalz	Sigma	B5525-5G
Glasplatten	Thomas Wissenschaftlich	Artikel-Nr.: 1188K51
Hoefer SQ3 Sequenzer	Hoefer	N/A
Bild: J Software	N/A	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/
Markierte RNA-Oligonukleotide	IDT	Sonderanfertigung
Pharmacia EPS 3500 Netzteil	Pharmazie	N/A
Steriflip 0.22 um Filter	Millipore	Artikel-Nr.: 5FCP00525
TEMED	BioRad	Tel.: 161-0800
Tris-Basis	Sigma	TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 Gel-Imager	GE Gesundheitswesen	N/A
Ultrareines DEPC-Wasser	Invitrogen	750023
Ultrareines Glycerin	Invitrogen	Artikel-Nr.: 19E1056865
Harnstoff	Fisher Chemical	U15-500