Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

Summary

Dieses Papier zeigt Methoden zur Isolierung, Aufreinigung und Detektion von Exosomen, sowie Techniken für die Analyse ihrer molekularen Inhalten. Diese Methoden sind anpassungsfähig für Exosom Isolation von beiden Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten, und kann darüber hinaus Analyse molekularer Inhalte auch in funktionellen Studien nützlich sein.

Abstract

Der Bereich der Exosom Forschung entwickelt sich rasant und mit einem dramatischen Anstieg der Veröffentlichungen in den letzten Jahren. Diese kleinen Bläschen (30-100 nm) von endocytischen Herkunft wurden zunächst vorgeschlagen, als eine Möglichkeit für Retikulozyten an den Transferrin-Rezeptor zu beseitigen, während Reifung in die Erythrozyten ^1-Funktion, und wurden später Exosomen benannt. Exosomen sind von innen Knospung späten Endosomen, Herstellung multivesicular bodies (MVBs) gebildet und in die Umwelt durch die Fusion der MVBs mit der Plasmamembran ² veröffentlicht. Seit der ersten Entdeckung der Exosomen, haben eine breite Palette von Zellen wurde gezeigt, dass diese Vesikel Release. Exosomen sind auch in mehreren biologischen Flüssigkeiten wie Plasma-, Nasen-Spülflüssigkeit, Speichel und Muttermilch ^3-6 nachgewiesen. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass der Inhalt und die Funktion der Exosomen auf dem ursprünglichen Zelle und die Bedingungen, unter denen sie hergestellt werden, hängt. Eine Vielzahl von Funktionen Dämonentrated für Exosomen, wie die Induktion von Toleranz gegenüber Allergenen ^7,8, zur Beseitigung der etablierten Tumoren in Mäusen ^9, Hemmung und Aktivierung der natürlichen Killerzellen ^10-12, Förderung der Differenzierung in regulatorischen T-Zellen ^13, Stimulation von T-Zell-Proliferation ¹⁴ und Induktion von T-Zell-Apoptose ^15. Jahr 2007 haben wir gezeigt, dass Exosomen aus Mastzellen freigesetzt messenger RNA (mRNA) und microRNA (miRNA) enthalten, und dass die RNA aus einer Zelle zur anderen über Exosomen befördert werden. In der Empfänger-Zellen wurde die mRNA durch Exosomen pendelte gezeigt, dass in ein Protein übersetzt werden, was auf eine regulatorische Funktion der übertragenen RNA ^16. Ferner haben wir auch gezeigt, dass Exosomen aus Zellen unter oxidativem Stress gewachsen abgeleitet werden kann Toleranz gegenüber weiteren Stress induzieren in den Empfängerländern Zellen und weisen somit eine biologische Funktion des exosomal Shuttle RNA ^17. Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten contain eine Mischung von Vesikeln und Schuppen Fragmente. Eine hochwertige Isolierung Methode für Exosomen, gefolgt von der Charakterisierung und Identifizierung der Exosomen und ihrer Inhalte ist daher von entscheidender Bedeutung, um Exosomen aus anderen Bläschen und Partikeln zu unterscheiden. Hier stellen wir eine Methode zur Isolierung von Exosomen aus beiden Zellkulturmedium und Körperflüssigkeiten. Diese Isolation Methode basiert auf wiederholte Zentrifugation und Filtration Schritte, um eine endgültige Ultrazentrifugationsschritt, in denen die Exosomen sind pelletiert gefolgt basiert. Wichtige Methoden der Exosomen Identifizierung und Charakterisierung der exosomal Morphologie und Eiweißgehalt sind hervorgehoben, einschließlich Elektronenmikroskopie, Durchflusszytometrie und Western Blot. Die Reinigung des gesamten exosomal RNA wird auf Spin-Säulenchromatographie basiert und die exosomal RNA-Ausbeute und Größenverteilung wird mit Hilfe eines Bioanalyzer.

Protocol

1. Exosom Isolation

1. Wachsen Zellen in Medium mit Exosom-freies Serum. So, etwaige Serum Zellkulturmedium sollte der Exosomen durch Ultrazentrifugation bei 120 000 xg über Nacht aufgebraucht bei 4 ° C vor dem Gebrauch.
2. Übertragen Sie die Zellsuspension auf konische Röhrchen.
3. Zentrifuge bei 300 xg für 10 Minuten bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren.
4. Übertragen Sie den Überstand in Röhrchen Ultrazentrifuge und wenn nicht ganz voll hinzufügen PBS.
5. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16 500 xg für 20 Minuten bei 4 ° C weiter zu entfernen Zellen und Zelltrümmer.
6. Den Überstand durch einen 0,2 um Filter, um Partikel größer als 200 nm zu entfernen.
7. Übertragen Sie die filtrierte Überstand auf neue Ultrazentrifuge Rohre und Abdichten der Rohre vor Ultrazentrifuge bei 120 000 xg für 70 Minuten bei 4 ° C bis Pellet die Exosomen.
8. Überstand verwerfen.
9. Für maximal Exosom Abruf, resuspendieren Exosom bereicherned Pellet wieder in einem kleinen Volumen (~ 3 x 50 ul) eines geeigneten Puffers. Dieser Puffer ist abhängig von der nachgeschalteten Experimente geplant im Anschluss an die Exosom Isolation. Zum Beispiel, Lysepuffer für Protein-und RNA-Isolierung verwendet wird, ist PBS für die Elektronenmikroskopie und Durchflusszytometrie und für funktionelle Untersuchungen Medium kann bevorzugt verwendet werden.

Beachten Sie, Exosomen können auch aus verschiedenen Körperflüssigkeiten, wie Plasma, mit dem gleichen Verfahren wie für Zellkulturmedien isoliert werden. Für viskose Flüssigkeiten kann es notwendig sein, um die Probe mit PBS vor der Zentrifugation und Filtration zu verdünnen. In Bezug auf die Zentrifugationsgeschwindigkeit für Punkt 5 oben, kann es zu 29 500 xg erhöht werden, und die Ultrazentrifugation in Punkt 7 können bis 90 Minuten ¹⁸ erweitert werden.

Wenn die Probe muss weiter gereinigt werden die Exosom Pellet kann auf einem Saccharose-Gradienten schwebte und die Exosomen wird vor allem in der Fraktion represe gefunden werdennting einer Dichte von 1,13-1,19 g / ml ^2.

2. Exosom Identifikation mittels Elektronenmikroskopie

1. Zur weiteren Beseitigung verunreinigenden Proteine, resuspendieren Exosom bereichert Pellet in PBS und Ultrazentrifuge bei 120 000 xg für 70 Minuten bei 4 ° C zu re-Pellet die Exosomen.
2. Nehmen Sie ein kleines Aliquot der Probe für Protein-Isolation und Gesamt-Protein-Messung. Stellen Sie sicher, dass nur ein kleiner Teil der Probe lysiert wird und für das Protein-Messung verwendet und halten Sie die intakte Exosomen, in PBS gelöst, separate auf Eis oder bei -80 ° C für weitere Experimente.
3. Geben Sie einen Tropfen etwa 10 ug exosomal Protein des intakten Exosomen in PBS resuspendiert, auf einem Parafilm. Dann mit einer Pinzette vorsichtig Stellung eine Formvar Kohlenstoff beschichtete Nickel-Gitter oben auf jeder Tropfen für 30-60 Minuten. Sicherstellen, dass das Netz mit der Beschichtung zugewandte Seite der Tropfen mit Exosomen positioniert ist.
4. Legen Sie drei Tropfen, je 30 ul PBS auf ter Parafilm und waschen das Gitter, indem nacheinander die Positionierung des Gitters auf der Tröpfchen der PBS, und verwenden Sie eine absorbierende Papier dazwischen. Verwenden Sie die Aufnahme Papier vorsichtig gerade, indem sie eng an der Seite des Rasters, ohne Kontakt mit der beschichteten Fläche.
5. Fix der Probe durch Hinterlegung eines Tropfens 2% Paraformaldehyd auf dem Parafilm und den Rost auf der Oberseite des Drop für 10 Minuten.
6. Wiederholen Sie den Waschvorgang in Nummer 4 vor Immunfärbung mit einem entsprechenden Antikörper. Häufig verwendete Antikörper sind anti-CD63 und anti-MHC-Klasse-II. Elektronenmikroskopie kann auch ohne Immunfärbung als Exosomen identifiziert allein auf Größe und Morphologie basiert durchgeführt werden. Wir empfehlen jedoch, um die Größe, Morphologie und das Vorhandensein einer Membran-Protein für eine abschließende Validierung bewerten.
7. Übertragen Sie die Raster auf einem 30 ul Tropfen der primäre Antikörper der Wahl und Inkubation für 40 Minuten. Wash durch Wiederholung Punkt 4, sondern nutzen 0,1% Rinderserumalbumin in PBS anstelle von PBS alleine.
8. Wiederholen Sie Punkt 7, aber mit der 10 nm-Gold-markierten sekundären Antikörper und waschen mit PBS allein.
9. Post-fix die Probe, indem ein Tropfen 2,5% Glutaraldehyd, die Parafilm und Inkubation des Gitters auf der Oberseite des Drop für 10 Minuten. Wiederholen Sie die Wäsche in Punkt 4, sondern verwenden Sie fünf Tropfen deionisiertes Wasser anstelle von drei Tropfen PBS.
10. Kontrast der Probe durch Zugabe eines Tropfen 2% Uranylacetat den Parafilm und Inkubation des Gitters auf der Oberseite des Drop für 15 Minuten.
11. Embed die Probe, indem ein Tropfen von 0,13% Methylzellulose und 0,4% Uranylacetat den Parafilm und Inkubation des Gitters auf der Oberseite des Drop für 10 Minuten.
12. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit einem absorbierenden Papier, bevor die Positionierung des Gitters auf ein Papier mit der beschichteten Seite nach oben und lassen Sie sie trocknen für 5 Minuten.
13. Untersuchen Sie die Präparate mit einem Elektronenmikroskop oder lagern Sie das Gitter in einer Gitterbox für die künftige Arbeit.

3.Exosom Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

Da Exosomen zu klein, um von den aktuellen Durchflusszytometrie Geräte erkannt werden, ist es notwendig, zuerst binden die Exosomen zu Antikörper-beschichteten Beads (Abbildung 1). Diese Perlen können entweder als fertiges Produkt erworben oder hergestellt im Labor mit dem Antikörper der Wahl. Je nach exosomal zellulären Ursprungs, können verschiedene Antikörper zu Perlen, die entweder kann der Magnet-oder Latex-Charakter gekoppelt werden. Wir verwenden derzeit anti-MHC-Klasse-II-oder Anti-CD63 beschichteten Beads für diese Analyse.

1. Für die Verwendung von "hausgemachten" Antikörper-beschichteten Kügelchen, verwenden wir 4 um Latexkügelchen mit anti-CD63 Antikörper beschichtet. Wash 25 ul 4 um Latexkügelchen (30 x 10 ⁶ Perlen) zweimal in 100 ul MES-Puffer, 3 000 xg für 15-20 Minuten abgeblasen, und der Pellet in 100 ul MES-Puffer. Bereiten Sie die Antikörper Gemisch mit einem Volumen gleich von 12,5 pg Antikörper mit dem gleichen Volumen von MES-Puffer. Fügen Sie diePerlen an den Antikörper Mischung und Inkubation unter Rühren über Nacht bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Antikörper-beschichteten Beads dreimal mit PBS (3 000 xg für 20 Minuten) und löst das Pellet in 100 ul Pufferspeicher (mit einer Endkonzentration von 300 000 Perlen / ul).
2. Für jede Probe (jeder Antikörper), mit einem Volumen gleich auf ein Minimum von 30 ug exosomal Protein (der intakten Exosomen in PBS gelöst) pro ~ 100 000 Antikörper beschichteten Kügelchen weiter.
3. Inkubieren Exosomen und Perlen, in einem Gesamtvolumen von 300 pl PBS, über Nacht bei 4 ° C unter leichter Bewegung.
4. Block durch Zugabe von 300 ul 200 mM Glycin und inkubieren für 30 Minuten.
5. Waschen Sie die Exosom-Bead-Komplexe zweimal in Waschpuffer (1-3% Serum in PBS), 600 g für 10 Minuten.
6. Inkubieren Sie die Exosom-Bead-Komplexe mit 50 ul IgG-Antikörper bei 4 ° C. Waschen Sie die Exosom-Bead-Komplexe zweimal in Waschpuffer wie in Schritt 5 beschrieben.
7. Add 90 ul Waschpuffer und 10 ulAntikörper der Wahl (am besten anti-CD9, anti-CD63 oder Anti-CD81) zur Exosom-Bead-Komplexe und inkubieren für 40 Minuten unter leichter Bewegung. Waschen Sie die Exosom-Bead-Komplexe zweimal in Waschpuffer wie in Schritt 5 beschrieben.
8. Geben Sie 300 ul Waschpuffer und Erfassung von Daten mittels Durchflusszytometrie.

Wie oben besprochen, verschiedene Perlen können verwendet werden, wie Latexkügelchen wie im Protokoll oder magnetische Perlen beschrieben. Wenn magnetische Kügelchen statt verwendet werden, bitte beachten Sie, dass das Protokoll etwas anders ist. Die Sperrung Schritt (Punkt 4) ist nicht erforderlich und die Wäsche ist, indem das Röhrchen in einem Magnetfeld stehen statt einer Zentrifugation durchgeführt.

Der Pufferspeicher für die "hausgemachten" Antikörper-beschichteten Kügelchen verwendet, enthalten 0,1% Glycin und 0,1% Natrium in PBS azid, mit einem pH von 7,2.

Wichtig ist, achten Sie darauf, die Exosom erschöpft Serum für die Durchflusszytometrie Waschpuffer (1-3% Serum in PBS) verwenden, um alle zu vermeidenSerum Exosomen Kontamination der Analyse.

Beachten Sie, bei der Durchführung Exosom Charakterisierung durch Antikörper gekoppelt Perlen ist es wichtig anzuerkennen, dass es nur eine spezifische Subpopulation, die spezifisch für die Antikörper verwendet, die isoliert und charakterisiert.

4. Exosom Erkennung durch Western-Blot

Western-Blot ist eine etablierte Methode, und wir werden nicht ins Detail gehen über die Methode selbst, sondern konzentrieren sich auf die Bedeutung eines geeigneten Proteinisolierung vor dem Western-Blot und die verschiedenen Antikörpern verwendet.

1. Lösen Sie die Exosom Pellet in das Protein Lysepuffer der Wahl und Pipettieren gründlich, gefolgt von Vortex-Mixen. Zur weiteren Lyse der Exosomen, beschallen die Probe in ein Wasserbad 3 x 5 Minuten mit Vortex-Mischen dazwischen. Schließlich Zentrifuge der Probe, 13 000 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen.
2. Messre des gesamten Proteins durch ein Verfahren zur Auswahl und laden 20-50 pg Protein pro Well.
3. Separate und Transfer der Proteine ​​mittels Gelelektrophorese und Elektroblotting.
4. Block und waschen Sie die Membran vor der Durchführung Immunfärbung gegen Proteine ​​in Exosomen bereichert.
5. Ermitteln Sie die spezifischen Proteins durch Chemilumineszenz, Digital Imaging und Analyse-Software.

Da es keine Exosom spezifische Marker, Proteine, die in Exosomen angereichert sind, aus allen unterschiedlichen zellulären Ursprung sind, werden häufig für Exosom Detektion verwendet. Dies sind Proteine ​​wie Tetraspaninen (zB CD9, CD63 und CD81), Zytoskelett assoziierten Protein (zB Ezrin) und Proteinen in multivesicular Biogenese (zB Tsg101 und alix) beteiligt. Andere Proteine, die auch häufig in Exosomen nachgewiesen werden Flotillin, Hsc70 und unterschiedlichen Rab-Proteine ​​etc. Es gibt jedoch auch Zellen bestimmte Proteine ​​in Exosomen wie A33 (Darmepithelzellen) gefunden, CD3(T-Zellen) und MHC-Klasse II (Antigen-präsentierenden Zellen). So kann je nach dem, was Zelltyp der Exosomen sind von den Markern für den Nachweis frei variieren.

Wie andere Kompartimente der Zelle auch Vesikel produzieren kann, wird außerdem empfohlen, um die Anwesenheit von Proteinen aus diesen Kompartimenten wie dem endoplasmatischen Retikulum (zB Calnexin und Grp78) und dem Golgi-Apparat (zB GM130) zu bestimmen. So zeigt Mangel an diese Proteine ​​keine oder nur geringe Kontamination von Vesikeln aus anderen Fächern in der Probe untersucht.

5. Isolierung von RNA und RNA exosomal Analyse

1. Lösen Sie die Exosom Pellet in der RNA-Lysepuffer der Wahl und führen Sie die RNA-Extraktion. Verschiedene RNA-Isolierung Kits können je nach Downstream Experimente verwendet werden, aber Spalte basierenden Methoden bietet Proben mit einem breiteren Spektrum von RNA. Wir sind derzeit mit miRCURY RNA Isolation Kit von Exiqon, aber auch andere Kits geeignet sein kann je nach scientific Frage auf der Hand.
2. Bei der Durchführung von RNA-Isolierung ist es wichtig, in ein RNase-freies Umfeld zu arbeiten. Verwenden Sie daher Nukleinsäure-und Nuklease frei Pipettenspitzen und wischen beiden Bank und frei von Schadstoffen und RNasen.
3. Für die RNA-Isolierung, mit miRCURY RNA Isolation Kit, lösen sich die Exosom Pellet in 350 ul Lyse-Lösung und führen Vortex-Mischen für 15 Sekunden.
4. Add 200 ul 95% igem Ethanol und Vortex-Mischen für 10 Sekunden.
5. Legen Sie eine Spalte in einer Sammel-Tube und übertragen Sie die lysiert Exosomen, um die Spalte und Zentrifuge 1 Minute bei 14 000 x g.
6. Dreimal durch Zugabe von 400 ul der Waschlösung in der Spalte mit den exosomal RNA und Zentrifuge für 1 Minute bei 14 000 x g.
7. Zentrifugieren Sie die Spalte für 2 Minuten bei 14 000 xg, um sicherzustellen, dass die Säule trocken ist und statt der trockenen Säule in ein RNase-freies Eppendorf-Röhrchen.
8. Dann werden 50 ul Elutionspuffer auf die Säule und zentrifugieren für 2 Minuten bei 200 xg, von 1 Minute bei 14 000 x g. gefolgt
9. Fahren Sie mit der isolierten RNA oder lagern Sie es in -80 ° C.

Für die Detektion und Analyse der extrahierten Gesamt-RNA exosomal, verwenden Sie ein Agilent 2100 Bioanalyzer mit der RNA 6000 Nano-oder RNA 6000 Pico Kit. Die Analyse zeigt die exosomal RNA-Ausbeute und Größenverteilung.

6. Repräsentative Ergebnisse

Exosomen sind zu klein, um durch die verfügbaren Durchflusszytometrie Methoden nachgewiesen werden, und sind daher auf Antikörper-beschichteten Beads vor der Analyse beigefügt (Abbildung 1). Als Exosom-Bead-Komplexe können aggregieren die Durchflusszytometrie Streudiagramm können verschiedene Populationen von Einzel-, Doppel-und Dreifach-Perlen (Abbildung 2A). Der Pfeil zeigt die einzelnen Perlen, die weiter analysiert werden. Ein CD63 positive einzelne Perle-Exosom Bevölkerung im Vergleich zu seinem Isotyp-Kontrolle ist in Abbildung 2B gezeigt.

e_content "> Aufgrund der geringen Größe der Exosomen, können sie nur direkt visualisiert mit Elektronenmikroskopie, und nicht durch Licht-Mikroskopie. Typische morphologische Merkmale von Exosomen sind rund geformt und 30-100 nm großen Vesikeln. In Abbildung 3, Elektronenmikroskopie Fotografien zeigen Exosomen immungefärbt (A) mit Gold-markierten Antikörper für CD63 (angezeigt durch den Pfeil) und Nicht-immungefärbt Exosomen (B).

Um festzustellen, dass die isolierte Vesikel tatsächlich Exosomen und zur weiteren Charakterisierung des exosomal Proteinen, Western Blot häufig verwendet. Abbildung 4 zeigt die Abwesenheit von Calnexin, ein endoplasmatisches Retikulum Marker. Dies deutet darauf hin geringer Verunreinigung von Vesikeln aus dem endoplasmatischen Retikulum. Des Weiteren zeigt Abbildung 4 die Präsenz von CD81 in Exosomen, die eine tetraspanin häufig in Exosomen angereichert ist.

Cellular RNA enthalten im Wesentlichens ribosomalen RNA (rRNA), wie die beiden prominenten Peaks für die 18S und 28S rRNA-Untereinheiten in einem Bioanalyzer-Analyse (Abbildung 5A) zu sehen. Allerdings unterscheiden sich exosomal RNA in ihr Profil als Exosomen die beiden rRNA Peaks (18S und 28S) fehlen und sind in kurze RNA, wie mRNA und miRNA (Abbildung 5B) angereichert.

Abbildung 1. Aufgrund der geringen Größe der Exosomen (30-100 nm), können sie nicht von Lärm und Hintergrund zu unterscheiden, wenn sie mit Durchflusszytometrie analysiert. Daher ist es notwendig, sie zu Antikörper-beschichteten Kügelchen vor der Exosomen analysiert werden, die dann visualisiert werden durch den Laser anhängen können.

Abbildung 2. Die Exosom-Perlen-Komplex kann insgesamt mit einander und bilden Doppel-und Dreifach-Perlen (A). Der Pfeil demonstriert die einzelne Perle-exo bestimmte Bevölkerungsgruppen, die gated und zur weiteren Analyse verwendet wird. Diese Bevölkerung wird direkt mit einem Isotyp-Kontrolle (gefüllt grau peak) auf das Vorhandensein von Membran-Moleküle der Exosomen bestimmen verglichen werden. CD63 positive Exosomen (schwarz offene Spitze) sind in Abbildung B dargestellt.

Abbildung 3. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Exosomen mit der typischen Morphologie und Größe (40-80 nm) (A und B). Der Pfeil in Abbildung A zeigt die goldene Partikel des sekundären Antikörpers, Verifizieren, dass diese Exosom CD63 haben auf ihrer Membranoberfläche.

Abbildung 4. Western-Blot-Ergebnisse, die die Abwesenheit des endoplasmatischen Retikulums Protein Calnexin aber die Anwesenheit des Proteins häufig in Exosomen, tetraspanin CD81 bereichert.

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Abbildung 5. Bioanalyzer Ergebnisse zeigen Präsenz RNA in Zellen (A) und Exosomen (B). Arrows zeigt die 18S und 28S rRNA-Untereinheiten in Zellen. Als exosomal RNA männlicher kleine RNA enthalten keine oder nur geringe rRNA ist in Exosomen identifiziert.

Discussion

Bei der Untersuchung der molekularen Inhalten und / oder Funktion von Exosomen, ist es wichtig, eine qualitativ hochwertige Isolierung Methode, die eine angemessene Rendite und möglichst geringen Grad der Verunreinigung bereitstellt. Die Methodik in diesem Papier beschrieben ist ein gut etabliertes Konzept zur Isolierung von Exosomen und ihrer RNA-Gehalt und die biologische Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus ist die Bedeutung der Charakterisierung der isolierten Exosomen, durch eine Kombination verschiedener Methoden, einschließlich der Elektronenmikroskopie, Durchflusszytometrie und Western Blot, hervorgehoben.

Bei der Isolierung Exosomen, ist der erste Zentrifugationsschritt (300 xg), um Zellen, die vorhanden sein in der Zellsuspension oder den untersuchten biologischen Flüssigkeit könnte verwendet werden. Die zweite Zentrifugation bei 16 500 xg muss stark genug sein, um Pellets toten Zellen, Grobschmutz, apoptotische Körper und anderen Organellen. Nach dieser Zentrifugation, sind einige Protokolle eine Nano-Filtration, aber einige investigators haben diesen Schritt ausgeschlossen. Allerdings betonen wir die Bedeutung der Beseitigung der Fragmente und Vesikel größer als 200 nm und daher dringend mit einem Filtrationsschritt empfehlen. Wenn ein strenger Isolation erforderlich ist, kann 100 nm-Filter verwendet werden, aber beachten Sie, dass, wenn viskose Flüssigkeiten verwendet werden, diese Filter leicht verstopft und exosomal Material verloren geht. Es kann auch ein 100 nm Filtration Auswirkungen auf die Morphologie der Exosomen und darüber hinaus, wenn Exosomen im größeren Maßstab sind sie verloren gehen. So scheinen die 200 nm-Filter geeignet für Exosom Isolation. Nach der Filtration wird das obligatorische Ultrazentrifugation bei 120.000 xg für Pellet der Exosomen verwendet. Die Exosomen kann weiter mit PBS gewaschen werden, gebunden an Antikörper-beschichteten Beads und gewaschen, oder auf einen Saccharose-Gradienten, um eine Verunreinigung Proteine ​​zu entfernen. Allerdings kann dies eine sehr ressourcenintensiv Prozess, den wir argumentieren nicht notwendig zu sein, vor allem wenn der Ausgangspunkt Probenvolumen ist klein und / oder der RNA-Gehalt of der Exosomen ist gering, da zusätzliche Schritte deutlich verringern wird das Material weiter. Doch hier sollte die Natur des isolierten Vesikel durch die Anwesenheit und Abwesenheit von bestimmten Proteinen nachgewiesen werden.

Bis heute hat keine absolut einzigartiges Protein-Marker für Exosomen identifiziert worden, um sicherzustellen, dass die Probe Exosomen und nichts anderes enthält. Als Ergebnis sind eine Kombination von Methoden erforderlich, um die Exosomen, einschließlich der Bestimmung der Größe und Morphologie der Exosomen durch Elektronenmikroskopie zu charakterisieren. Auch die Reinheit der Probe durch Elektronenmikroskopie bestimmt werden, da diese Methode einen Überblick über den Grad der Kontamination der Probe, zum Beispiel mit größeren Bläschen, wie Mikropartikel, apoptotische Körper oder Zelltrümmer bieten. Darüber hinaus kann der Proteingehalt der Exosomen mittels Durchflusszytometrie und Western Blot bestimmt werden, und die Kombination dieser beiden Methoden ergibt sich eine Analyse sowohl der Membran gebunden (zB CD63 undCD81) und verinnerlicht Proteine ​​(zB Tsg101 und alix) der Exosomen. Nachweis von Proteinen in Exosomen, wie CD63, Tsg101 und Alix, und das Fehlen von Proteinen wie dem endoplasmatischen Retikulum Protein Calnexin bereichert, ist ein Indiz dafür, dass die Exosom bereichert Pellet ist in der Tat Exosomen und nicht verunreinigt Vesikel aus anderen Kompartimenten der Zelle.

Das Profil der RNA, die in Exosomen erkannt wird unterscheidet sich grundlegend von dem der RNA in intakten Zellen gefunden. So fehlt exosomal RNA durch Bioanalyzer oder in Gel-basierten RNA-Analyse Ansätze analysiert die beiden Peaks für die 18S und 28S rRNA-Untereinheiten, die prominent in Analyse der zellulären RNA werden. Wir plädieren deshalb, die angibt, den Nachweis einer signifikanten Mengen an rRNA in einer Probe, die die Gesamt-RNA extrahiert nicht von exosomal Herkunft allein, und damit, dass die Isolierung Methode verbessert und qualitätsgesichert braucht.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Exosom Isolation
Optima L-90K Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	65670
Quick-Siegel Ultrazentrifuge Rohre	Beckman Coulter		Je nach dem Rotor verwendet verschiedene Rohre benötigt werden. Ti70 (342.414), Ti45 (345776)
Quick-Seal Cordless Rohr Topper Kit	Beckman Coulter	358312
Filtropur Syringe Filter, 0.20μm	Sarstedt	83.1826.001	Für Viskose Flüssigkeiten und / oder große Mengen, eine Vakuum-Filtration-System, 0,2 um, von VWR International kann stattdessen verwendet werden (514-0600).
Elektronenmikroskopie
Formvar / Kohlenstoff beschichtete Nickel-Grids	Ted Pella Inc.	1GN200
Mouse-anti-human CD63	BD Bioscience	556019	Endkonzentration: 0.05μg/μl
Isotyp-Kontrolle; IgG1κ (MOPC 21)	Sigma-Aldrich	M9269	Endkonzentration: 0.05μg/μl
Anti-Maus-IgG-Gold-Konjugat, 10 nm	Sigma-Aldrich	G7777	Endkonzentration: 1%
LEO 912AB Omega Elektronenmikroskop	Carl Zeiss NTS		Oder gleichwertiges Gerät.
Durchflusszytometrie
4 &mgr; Aldehyd / Sulfat Latexkügelchen	Grenzflächen-Dynamics	12-4000
Antikörper für die Beschichtung der Latexkügelchen			Zum Beispiel anti-CD63 von BD Bioscience (556019)
Intelli-Mixer RM-2L	ELMI		Oder gleichwertiges Gerät.
IgG aus humanem Serum	Sigma-Aldrich	I4506
Antikörper für den Nachweis	BD Bioscience		Zum Beispiel: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) Isotyp-Kontrolle (555749)
BD FACSAria	BD Bioscience
Western Blot
Transsonic T 490 DH	ELMA		Oder gleichwertiges Gerät.
Isolierung von RNA und RNA exosomal Analyse
miRCURY RNA Isolation Kit	Exiqon A / S	300110
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939A