Zweidimensionale semi-denaturierende Agarose-Gelelektrophorese: Eine Technik zur Trennung polymorpher Amyloidfasern basierend auf Größenheterogenität

Zusammenfassung

Quelle: Hanna-Addams, S., et al. Verwendung einer zweidimensionalen, halbdenaturierenden Agarose-Gelelektrophorese zur Bestätigung der Größenheterogenität von Amyloid oder Amyloid-ähnlichen Fasern. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert die auf zweidimensionalen halbdenaturierenden Agarosegelelektrophoresen basierende Trennung von Amyloidfasern. Die Technik trennt die polymorphen Amyloid-Aggregate anhand ihrer heterogenen Größe.

Protokoll

>1. Proben vorbereiten

1. Kultur von 2 x 10⁶ Amyloid-produzierenden HT-29-Dickdarmkrebszellen in einer 10-cm-Gewebekulturschale in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum und Penicillin-Streptomycin. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂.
   1. Nachdem die Zellen auf 80 % Konfluenz angewachsen sind, waschen Sie die Zellen mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). 3 ml Trypsin-Lösung zugeben und 3 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
   2. Nachdem die Zellen vollständig von der Schale dissoziiert wurden, fügen Sie 10 ml Kulturmedium hinzu und übertragen Sie die Zellen mit einer 10-ml-Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das Medium, resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml Kulturmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler. Teller 2 x 10^{je 6} Zellen in zwei 10-cm-Schalen.
   3. Lassen Sie die Zellen über Nacht in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ anhaften und sich erholen. Die Behandlung wird auf eine Schale angewendet, um die Bildung von Amyloiden mit 20 ng/ml Tumornekrosefaktor-Alpha (TNF-α), 100 nM Smac-Mimetikum und 20 μM Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK zu induzieren. Die Kombination wird als TSZ abgekürzt. Behandeln Sie das andere Gericht mit dem Vehikel als Kontrolle.
2. Nach der entsprechenden Zeitspanne, in der Regel 6 Stunden, ernten Sie das Zelllysat.
   1. Kratzen Sie die Zellen mit einem Plastikschaber von der Platte ab und verwenden Sie eine 10-ml-Pipette, um sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen zu überführen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei 4 °C.
   2. Waschen Sie die Zellen 2 Mal, indem Sie sie in 10 mL eiskaltem PBS resuspendieren und bei 1.000 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren. Aspirieren Sie die PBS-Lösung.
      Anmerkung: Hier kann der Prozess pausiert werden, indem das Zellpellet in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu 1 Monat bei ˗80 °C gelagert wird.
   3. Übertragen Sie das Zellpellet in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie es 30 Minuten lang in 0,3 mL Lysepuffer auf Eis. Zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 15 min bei 4 °C. Der Überstand ist das Ganzzelllysat.
      Anmerkung: Hier kann der Prozess pausiert werden, indem die Probe bis zu mehreren Monaten bei -20 °C gelagert wird.
   4. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay. Fügen Sie 4x SDD-AGE-Ladepuffer hinzu, um 20 μl der 3 μg/μl Probe vorzubereiten, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

>2. Gele vorbereiten und ausführen

1. 2 g Agarose zu 200 mL 1x Trisacetat-Puffer (TAE) in ein Becherglas geben und in der Mikrowelle erhitzen, um die Agarose zu schmelzen. Fügen Sie 1 ml 20 % SDS hinzu, um eine Endkonzentration von 0,1 % SDS zu erhalten. Vorsichtig schwenken, um sich zu vermischen. Achten Sie darauf, dass nach der SDS-Zugabe keine Blasen entstehen.
2. Gießen Sie die Agaroselösung in eine 15 cm x 14 cm große Gelplatte. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um Blasen zu entfernen. Legen Sie einen 20-Well-Kamm an die Spitze.
3. Erste Dimension: Pipettieren Sie 60 μg Ganzzelllysat auf der äußersten rechten Spur. Lassen Sie das Gel etwa 4 h lang bei 60 V laufen (bis die Farbstofffront etwa 3/4 durch das Gel hindurch ist), wobei der TAE mit 0,1 % SDS als Laufpuffer verwendet wird.
4. Zweite Dimension: Drehen Sie das Gel vorsichtig um 90° gegen den Uhrzeigersinn (Abbildung 1A). Lassen Sie das Gel bei 60 V für ca. 4 h.
   laufen Anmerkung: Der allgemeine Betriebszustand beträgt 4 V/cm Gellänge. Es ist wichtig, dass die Laufbedingungen für die erste und zweite Dimension genau gleich sind.

Ergebnisse

Abbildung 1. Experimentelles Protokoll.(A) Schematische Darstellung der zweidimensionalen halbdenaturierenden Agarose-Gelelektrophorese (2D SDD-AGE). Beginnen Sie damit, die Probe auf die Spur ganz rechts zu laden, die rot gekennzeichnet ist. Nach Beendigung des ersten Dimensionslaufs drehen Sie das Gel um 90° gegen den Uhrzeigersinn. Führen Sie die Elektrophorese der zweiten Dimension durch. Der du...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gelelektrophorese-Einheit	Fischer	HE99XPRO	Appratus für Gel Running.
Agrose	VWR	Artikel-Nr.: 97062-250	Für Agarose-Gel.
DMEM	Sigma	Nr. D6429	für Zellkultur
Fötales Rinderserum	Sigma	Nr. F4135	für Zellkultur
Penicilin-Streptomycin	Sigma	Nr. P4333	für Zellkultur
Trypsin-Lösung	Sigma	Nr. T4049	für Zellkultur
PBS für die Gewebekultur	Sigma	Nr. D8662	für Zellkultur
rekombinantes TNF	Hergestellt in unserem Labor		zur Induktion von Nekroptose. Siehe Referenz 11.
smac-mimetisch	Geschenk von Dr. Xiaodong Wang		zur Induktion von Nekroptose. Siehe Referenz 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	Nr. A1902	zur Induktion von Nekroptose. Siehe Referenz 11.
Zell-Zähler	Bio-Rad	1450102	Modell TC20; zum Zählen von Zellen
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 23225	zur Messung der Proteinkonzentration in Zelllysaten
Zell-Lifter	Fischer	Tel.: 07-200-364	So entfernen Sie Zellen aus der Schale
Lyse-Puffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL Glycerin 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (Protease- und Phosphatinhibitoren nach Wunsch)
10X TAE (1 L)			48,4 g Tris Basis 11,42 mL Eisessig 20 mL 0,5 M EDTA pH 8 ddH20 bis 1 L
4X SDD-AGE Ladepuffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL Glycerin 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10 % Bromphenolblau 31 mL ddH2O
PBST Waschpuffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4,2H 2O 24 g KH2VE4 ddH2Ω bis 10 L hinzufügen