Multimer-PAGE zur Trennung nativer Proteinkomplexe: eine hybride Trenntechnik bestehend aus blauem native-PAGE und SDS-PAGE zur Trennung intakter multimerer Proteine aus Gewebelysat

Abstract

Quelle: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: Eine Methode zum Einfangen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video beschreibt multimere PAGE zur Trennung von nativen Proteinkomplexen aus Gewebehomogenaten. Die Technik ist eine Mischung aus Blue Native-PAGE- und SDS-PAGE-Techniken. Die getrennten Komplexe können charakterisiert und auf ihre Rolle bei der Zellfunktion untersucht werden.

Protocol

>1. Vorbereitung des Gewebes

1. Bereiten Sie 10 mL 4x BN-PAGE Probenpuffer vor (200 mM Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40 % w/v Glycerin, 0,004 % Ponceau S, pH 7,2).
   Anmerkung: Diese Stammlösung kann im Voraus hergestellt und bei 4 °C gelagert werden.
2. 250 μl 4x Probenpuffer in 750 μl dH₂O mit 1x handelsüblichem Proteasehemmer-Cocktail verdünnen. Vortex und Chill auf Eis.
3. Homogenisieren Sie 20 mg Zielgewebe in dem 1 mL 1x eiskalten BN-PAGE-Probenpuffer mit 30 Hüben eines Clean Dounce Homogenisators.
   Anmerkung: Für dieses De....

Results

Abbildung 1: Allgemeines Multimer-PAGE-Flussdiagramm.
(A) Gewebelysat mit nicht denaturierenden Methoden herstellen, wie z. B. Homogenisieren in BN-PAGE-Probenpuffer. (B) Pipettieren Sie das Lysat in das BN-PAGE-Gel und führen Sie dann eine Elektrophorese (150 Volt) im BN-PAGE-Laufpuffer durch. Lassen Sie die Probe wandern, bis die Farbstofffront ~2 cm in das auflösende Gel gewa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemikalien
ε-Aminocapronsäure	Sigma	Nr. A2504
Acrylamid	Acros Organics	164855000	giftig.
Acrylamid/Bisacrilamid 37,5:1 (40%T Stammlösung)	BioRad	Tel.: 161-0148	giftig.
Ammoniumpersulfat	Sigma	Nr. A3678
Anti Kaninchen IgG-HRP von Ziege	Santa Cruz Biotechnologie	SC-2004
Bicinchoninsäure-Assay-Kit	Thermofischer	Artikel-Nr.: 23225
Bis-tris	Sigma	Nr. B9754
Rinderserumalbumin	Sigma	Nr. A9647
Butanol	Fisher Scientific	Nr. A399-1
Chemilumineszenz-Substrat-Kit	ThermoFisher	Artikel-Nr.: 24078
Coomassie blau G-250	Sigma-Aldrich	Nr. B0770
Digitonin	Sigma	Nr. D141	giftig.
Dimethylsulfoxid	Fisher Scientific	Nr. D128-1
Dithiobis (Succinimidylpropionat)	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 22585
Magerfreie Trockenmilch	LabScientific	Nr. M0841
Glycerin	Sigma	Nr. G9012
Glycin	Fisher Scientific	Nr. BP381-5
Stoppen Sie den Proteasehemmer-Cocktail	Thermofischer	Artikel-Nr.: 78430
Salzsäure	Fisher Scientific	Nr. A144SI-212	Zur Titration. Ätzend.
Methanol	Fisher Scientific	Nr. A412-4	Für die Aktivierung von PVDF-Membranen. Giftig.
Monoklonales Anti-α-Synuclein-IgG aus Kaninchen	Santa Cruz Biotechnologie	sc-7011-R
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin	Sigma	Nr. T9281
N,N'-Methylenbisacrylamid	Acros Organics	Artikel-Nr.: 16479	giftig.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbat 20 (Tween-20)	Fisher Scientific	Nr. BP337-500
Polyvinylidenfluorid-Transfermembranen	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 88518
Ponceau S	Sigma	Nr. P3504
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	Seite 217-3
Kaliumphosphat einbasisch	Sigma	Nr. P9791
Proteasehemmer-Cocktail	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 88265
SDS-Lösung (10 % w/v)	BioRad	Tel.: 161-0416
Natriumchlorid	Fisher Scientific	Nr. BP358-212
Natriumdodecylsulfat	Sigma	Nr. L37771
Natriumphosphat einbasisch	Fisher Scientific	Nr. BP329-1
Tricin	Sigma	Nr. T0377
Tris-Basis	Fisher Scientific	Nr. BP152-500
Tris-HCl (0,5 M Puffer, pH 6,8)	BioRad	Tel.: 161-0799
Tris-HCl (1,5 M Puffer, pH 8,8)	BioRad	Tel.: 161-0798
Instrumente
GE Imagequant LAS 4000	GE Gesundheitswesen	Tel.: 28-9558-10
ImageJ Software NIH
Synergy H1 Mikroplatten-Reader	BioTek
Gelformer + Ständer	Biorad
Microfuge 22R Zentrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce Homogenisator
Vortex-Mischer	Fisher Scientific
Ultraschall-Gewebehomogenisator	Fisher Scientific	FB120220