Multimer-PAGE zur Trennung nativer Proteinkomplexe: eine hybride Trenntechnik bestehend aus blauem native-PAGE und SDS-PAGE zur Trennung intakter multimerer Proteine aus Gewebelysat

Abstract

Quelle: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: Eine Methode zum Einfangen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video beschreibt multimere PAGE zur Trennung von nativen Proteinkomplexen aus Gewebehomogenaten. Die Technik ist eine Mischung aus Blue Native-PAGE- und SDS-PAGE-Techniken. Die getrennten Komplexe können charakterisiert und auf ihre Rolle bei der Zellfunktion untersucht werden.

Protocol

>1. Vorbereitung des Gewebes

1. Bereiten Sie 10 mL 4x BN-PAGE Probenpuffer vor (200 mM Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40 % w/v Glycerin, 0,004 % Ponceau S, pH 7,2).
   Anmerkung: Diese Stammlösung kann im Voraus hergestellt und bei 4 °C gelagert werden.
2. 250 μl 4x Probenpuffer in 750 μl dH₂O mit 1x handelsüblichem Proteasehemmer-Cocktail verdünnen. Vortex und Chill auf Eis.
3. Homogenisieren Sie 20 mg Zielgewebe in dem 1 mL 1x eiskalten BN-PAGE-Probenpuffer mit 30 Hüben eines Clean Dounce Homogenisators.
   Anmerkung: Für dieses Demonstrationsexperiment ist das Zielgewebe das gesamte Hirngewebe einer Ratte. Nach der Homogenisierung können die Proben mit einem milden Detergenz, wie z. B. 2 % Digitonin, behandelt werden, um die Solubilisierung zu ermöglichen und die Elektrophorese von Membranproteinen zu ermöglichen.
4. Übertragen Sie das Homogenat in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 30 Minuten lang bei 14.000 x g, um unlösliche zelluläre Inhalte zu pelletieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in ein sauberes Röhrchen auf Eis umgefüllt.
5. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Überstandsproteinkonzentration mit Bicinchoninsäure (BCA) oder einem ähnlichen Proteinquantifizierungsassay zu messen.
6. Wenn die Homogenatprobe(n) Reinigungsmittel enthalten, ist eine Menge von 5 % Coomassie Blue G-250 in einer wässrigen Lösung zuzugeben, die ausreicht, um die Homogenatlösung auf 0,25 % Coomassie zu bringen.

>2. BN-SEITE

1. Verdünnen Sie 25 mL 20x Blue Native (BN) Elektrophorese-Puffermaterial (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M Tricin, pH 6,8) in 475 mL dH₂O mit 0,002 % Coomassie Blue, um 500 mL 1x Laufpuffer herzustellen.
   1. Wenn Proben Detergens enthalten, stellen Sie stattdessen 250 ml 1x Laufpuffer mit 0,02 % Coomassie und weitere 250 ml ohne Reinigungsmittel her.
2. Puffer(n) auf 4 °C abkühlen lassen.
3. Reinigen und montieren Sie eine Polyacrylamid-Gel-Gießkassette gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Gießen Sie BN Polyacrylamid-Gel (3 % T Stapelschicht, 6 % T auflösende Schicht) nach einem Standardrezept und platzieren Sie den Well-Kamm.
5. Nachdem die Gele polymerisiert sind, spülen Sie die Kassette mit dH₂O und montieren Sie die Elektrophoreseapparatur gemäß den Anweisungen des Herstellers.
6. Entfernen Sie den Well-Kamm und füllen Sie die Wells mit 1x BN-PAGE Laufpuffer. Vermeiden Sie es, die gesamte Innenkammer mit Puffer zu füllen, bis die Proben geladen sind.
   1. Wenn die Proben Reinigungsmittel enthalten, füllen Sie die Vertiefungen mit dem Puffer mit 0,02 % Coomassie Blue.
      HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.7-2.9 bei 4 °C durch.
7. Pipettieren Sie mit Gelladespitzen ein Homogenatvolumen mit 20 μg Protein in die gewünschten Wells. Pipettieren Sie ein äquivalentes Volumen von 1x BN-PAGE Probenpuffer in unbenutzte Vertiefungen.
   Anmerkung: Verwenden Sie die aus dem BCA-Assay ermittelte Proteinkonzentration, um das geeignete Volumen des Homogenats zu berechnen, das in die Vertiefungen gegeben werden soll.
8. Nachdem die Proben geladen wurden, füllen Sie die innere Kammer mit 1x BN-PAGE Laufpuffer. Stellen Sie sicher, dass das Gel vollständig in Puffer eingetaucht ist. Füllen Sie anschließend die äußere Kammer mit 1x Laufpuffer bis zu dem vom Hersteller angegebenen Füllstand.
   1. Wenn Proben Reinigungsmittel enthalten, ist die innere Kammer mit dem 1x-Puffer mit 0,02 % Coomassie Blue und die äußere Kammer mit farbstofffreiem 1x-Laufpuffer zu füllen.
9. Verbinden Sie die Elektroden mit der Stromversorgung und elektrophoresieren Sie die Proteine im Gel bei 150 V, bis die Farbstoffbande ~2 cm in die auflösende Schicht vordringt. Stoppen Sie die Stromversorgung und trennen Sie sie.

>3. Vernetzung

HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3.1-3.6 bei 4 °C durch.

1. Zerlegen Sie das Elektrophoresegerät und trennen Sie die Glasscheiben der Gelkassette. Entfernen und entsorgen Sie die Stapelschicht.
2. Schneide das Gel vorsichtig knapp unterhalb der Unterkante der Färbefront ein. Achten Sie darauf, diesen Schnitt so glatt und gerade wie möglich zu machen, und entsorgen Sie dann das unbenutzte Stück Gel. Dadurch bleibt ein ~2 cm breiter, horizontaler Streifen aus Polyacrylamidgel übrig, der das gesamte Protein in der Homogenatprobe enthält.
3. Schneiden Sie alle unbenutzten Teile entlang der Ränder des Gelstreifens ab.
4. Legen Sie den Streifen vorsichtig in einen kleinen Behälter mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und mischen Sie ihn vorsichtig durch Nutation für 30 Minuten, um ihn auszugleichen.
5. Nach der Äquilibrierung verwerfen Sie das PBS und ersetzen es durch weitere 10 ml. 500 μl 25 mM DSP, gelöst in Dimethylsulfoxid, in das PBS pipettieren und wie oben (Schritt 3.4) für 30 min weitermischen.
6. Gießen Sie die DSP-Lösung ab. Fügen Sie 10 ml 0,375 M Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl) mit einem pH-Wert von 8,8 hinzu, das 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, um das nicht umgesetzte DSP zu löschen. Setzen Sie die Nutation für 15 Minuten fort.

>4. SDB-SEITE

1. Während der Gelstreifen abschreckt, bereiten Sie SDS-PAGE-Gellösungen nach Standardmethoden vor. Fügen Sie keine Polymerisationsreagenzien hinzu.
2. Nach dem Abschrecken wird der ΒΝ-Gelstreifen wieder auf Raumtemperatur gebracht und in eine neue Gelkassette gegossen.
   1. Nehmen Sie dazu das Gel vorsichtig auf und legen Sie es auf eine saubere Gelkassetten-Abstandsplatte.
   2. Richten Sie den Streifen so aus, dass die Unterseite der Farbstofffront der Oberseite einer neuen Kassette am nächsten ist (d. h. die Seite, die während BN-PAGE am weitesten zurückgelegt wurde, sollte der Oberseite der neuen Kassette am nächsten sein; der Gelstreifen sollte von seiner vorherigen Ausrichtung umgedreht werden). Siehe Abbildung 1.
   3. Platzieren Sie den Streifen so, dass seine Oberkante auf einer Höhe der Oberkante der Abdeckplatte liegt (d. h. er befindet sich am oberen Rand des neuen Gels). Achte darauf, dass die Vorderseite des Farbstoffs parallel zu den horizontalen Kanten der Glasplatte verläuft.
   4. Schieben Sie eine Seite des herausgeschnittenen Streifens gegen eine der Abstandshalterwände, so dass auf der anderen Seite Platz für das Gel zum Gießen und zum Laden eines Proteinstandards oder einer Leiter bleibt.
   5. Wenn die Unterkante des Gelstreifens gezackte oder unebene Stellen enthält, schneiden Sie diese vorsichtig ab. Falls vorhanden, fangen sie beim Eingießen des Gels Blasen ein.
   6. Sobald der Gelstreifen richtig positioniert ist, legen Sie die Abdeckplatte über die Distanzplatte. Üben Sie sanften Druck aus, um eingeschlossene Luftblasen herauszudrücken.
   7. Fahren Sie mit dem Zusammenbau des Gel-Pouring-Geräts gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.
3. Fügen Sie dem auflösenden Gelpuffer Polymerisationsreagenzien hinzu und gießen Sie es mit einer serologischen Pipette in die vorbereitete Gelkassette. Füllen Sie die Gelkassette bis zu ~2 cm unter dem exzidierten BN-PAGE-Gelstreifen, um Platz für die Stapelschicht zu lassen.
4. Geben Sie 100 μl Butanol über das gegossene Gel und lassen Sie 30 Minuten für die Polymerisation der auflösenden Schicht warten. Gießen Sie das Butanol ab.
5. Fügen Sie Polymerisationsreagenzien zur Stapelgellösung hinzu. Gießen Sie die Stapelschicht mit einer serologischen Pipette ein, um den verbleibenden leeren Raum in der Gelkassette zu füllen.
   1. Kippen Sie die Gelkassette, während die Stapelschicht gegossen wird, so dass sie den Raum unter dem Gelstreifen ausfüllt und keine Luftblasen eingeschlossen werden.
   2. Während der Stapelgelpuffer den leeren Raum unter dem Gelstreifen ausfüllt, bringen Sie die Gelkassette nach und nach wieder auf einen ebenen Boden.
   3. Füllen Sie den leeren Raum neben dem herausgeschnittenen Gelstreifen weiter mit dem Stapelgelpuffer, bis er fast überläuft.
6. Lassen Sie die Stapelschicht 30 min.
   polymerisieren Anmerkung: Stellen Sie 10x SDS-PAGE Laufpuffer (250 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan (tris), 1,9 M Glycin, 1% SDS) her, während das Gel polymerisiert. Diese kann auch vorher hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert werden.
7. 50 mL 10x SDS-PAGE laufendes Puffermaterial auf 450 mL dH₂O verdünnen, um 1x Arbeitspuffer herzustellen.
8. Nachdem die Stapelschicht polymerisiert ist, nehmen Sie die Gelkassette aus der Gießvorrichtung, spülen Sie sie mit dH₂O ab und montieren Sie die Elektrophoreseapparatur gemäß den Anweisungen des Herstellers.
9. Füllen Sie die innere Kammer vollständig mit 1x SDS-PAGE Laufpuffer, dann füllen Sie die äußere Kammer bis zu dem vom Hersteller angegebenen Füllstand.
10. Beladen Sie den Raum neben dem exzidierten Gelstreifen mit einer Molekulargewichtsleiter oder einem geeigneten Proteinstandard.
11. Schließen Sie die Elektroden an die Stromversorgung an und elektrophoresieren Sie die Proben bei 120 V. Wenn der Coomassie-Farbstoff vom Gel abläuft, stoppen Sie die Stromversorgung und trennen Sie sie.
12. Analysieren Sie das Gel mit den Standardmethoden des Elektroblottings und des Proteinnachweises durch Antikörperbindung.

Results

Abbildung 1: Allgemeines Multimer-PAGE-Flussdiagramm.
(A) Gewebelysat mit nicht denaturierenden Methoden herstellen, wie z. B. Homogenisieren in BN-PAGE-Probenpuffer. (B) Pipettieren Sie das Lysat in das BN-PAGE-Gel und führen Sie dann eine Elektrophorese (150 Volt) im BN-PAGE-Laufpuffer durch. Lassen Sie die Probe wandern, bis die Farbstofffront ~2 cm in das auflösende Gel gewa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemikalien
ε-Aminocapronsäure	Sigma	Nr. A2504
Acrylamid	Acros Organics	164855000	giftig.
Acrylamid/Bisacrilamid 37,5:1 (40%T Stammlösung)	BioRad	Tel.: 161-0148	giftig.
Ammoniumpersulfat	Sigma	Nr. A3678
Anti Kaninchen IgG-HRP von Ziege	Santa Cruz Biotechnologie	SC-2004
Bicinchoninsäure-Assay-Kit	Thermofischer	Artikel-Nr.: 23225
Bis-tris	Sigma	Nr. B9754
Rinderserumalbumin	Sigma	Nr. A9647
Butanol	Fisher Scientific	Nr. A399-1
Chemilumineszenz-Substrat-Kit	ThermoFisher	Artikel-Nr.: 24078
Coomassie blau G-250	Sigma-Aldrich	Nr. B0770
Digitonin	Sigma	Nr. D141	giftig.
Dimethylsulfoxid	Fisher Scientific	Nr. D128-1
Dithiobis (Succinimidylpropionat)	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 22585
Magerfreie Trockenmilch	LabScientific	Nr. M0841
Glycerin	Sigma	Nr. G9012
Glycin	Fisher Scientific	Nr. BP381-5
Stoppen Sie den Proteasehemmer-Cocktail	Thermofischer	Artikel-Nr.: 78430
Salzsäure	Fisher Scientific	Nr. A144SI-212	Zur Titration. Ätzend.
Methanol	Fisher Scientific	Nr. A412-4	Für die Aktivierung von PVDF-Membranen. Giftig.
Monoklonales Anti-α-Synuclein-IgG aus Kaninchen	Santa Cruz Biotechnologie	sc-7011-R
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin	Sigma	Nr. T9281
N,N'-Methylenbisacrylamid	Acros Organics	Artikel-Nr.: 16479	giftig.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbat 20 (Tween-20)	Fisher Scientific	Nr. BP337-500
Polyvinylidenfluorid-Transfermembranen	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 88518
Ponceau S	Sigma	Nr. P3504
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	Seite 217-3
Kaliumphosphat einbasisch	Sigma	Nr. P9791
Proteasehemmer-Cocktail	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 88265
SDS-Lösung (10 % w/v)	BioRad	Tel.: 161-0416
Natriumchlorid	Fisher Scientific	Nr. BP358-212
Natriumdodecylsulfat	Sigma	Nr. L37771
Natriumphosphat einbasisch	Fisher Scientific	Nr. BP329-1
Tricin	Sigma	Nr. T0377
Tris-Basis	Fisher Scientific	Nr. BP152-500
Tris-HCl (0,5 M Puffer, pH 6,8)	BioRad	Tel.: 161-0799
Tris-HCl (1,5 M Puffer, pH 8,8)	BioRad	Tel.: 161-0798
Instrumente
GE Imagequant LAS 4000	GE Gesundheitswesen	Tel.: 28-9558-10
ImageJ Software NIH
Synergy H1 Mikroplatten-Reader	BioTek
Gelformer + Ständer	Biorad
Microfuge 22R Zentrifuge	Beckman Coulter
2 mL dounce Homogenisator
Vortex-Mischer	Fisher Scientific
Ultraschall-Gewebehomogenisator	Fisher Scientific	FB120220