Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Amplikons nach der PCR: Eine Methode zur Analyse von Produkten der Multiplex-PCR und zur Bewertung des Erfolgs von PCR-Reaktionen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Gulla, S. et al. Multi-Locus Tandem-Repeat-Analyse des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri mittels Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video demonstrieren wir die Trennung von bakterieller PCR-amplifizierter DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese. Agarose-Gel fungiert als molekulares Sieb, das es der negativ geladenen DNA ermöglicht, basierend auf ihrer Größe unter einem angelegten elektrischen Feld zu wandern.

Protokoll

>1. PCR-Amplikon-Bestätigung durch Gelelektrophorese

Bereiten Sie gemäß den Empfehlungen des Herstellers ein Volumen von 1,5 % (w/v) Agarosegel in 1x Tris-Borat-EDTA (FSME)-Puffer her, das für die Anzahl der zu testenden PCR-Reaktionen geeignet ist. Vor dem Gießen 5 μl fluoreszierender Nukleinsäurefarbstoff pro 50 μl Gellösung hinzufügen und mischen. Verwenden Sie für das Gießen Schalen und Kämme und lassen Sie eine angemessene Anzahl von Vertiefungen für DNA-Referenzleitern frei.
Nach dem Abbinden das Gel in 1x FSME-Puffer in ein GE-System tauchen. Mischen Sie 5 μl PCR-Produkt mit 2 μl Ladefarbstoff und geben Sie es in die Gel-Wells. Fügen Sie 5 μl DNA-Leiter in leere Vertiefungen als Referenz hinzu.
Lassen Sie das Gel ca. 1 h lang bei 110 V pro 15 cm laufen und verwenden Sie ein UV-basiertes Gel-Bildgebungs-/Visualisierungssystem, um das Vorhandensein mehrerer (bis zu fünf) Banden zu überprüfen, die PCR-Amplikons darstellen (siehe Beispiel in Abbildung 1). Entsorge das Gel. Lagern Sie die restlichen PCR-Produkte bis zur Weiterverarbeitung bei 4 °C.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Gelelektrophorese zur Überprüfung des Vorhandenseins mehrerer PCR-Produkte. Das Bild bestätigt das Vorhandensein mehrerer PCR-Amplikons in allen 12 Lanes mit Proben, wobei die erste Lane die verwendete DNA-Leiter darstellt. Die Größen ausgewählter Leiterfragmente wurden angegeben, ebenso wie der PCR-Assay und die Stammzugehörigkeit jeder Spur.