Kapillarelektrophorese: Eine Technik zur Analyse von fluoreszenzmarkierten Polymerase-Kettenreaktionsamplikons

Zusammenfassung

Quelle: Gulla, S. et al., Multi-locus Variable-number Tandem-Repeat-Analyse des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri mittels Multiplex-PCR und Kapillarelektrophorese. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video beschreibt die Technik der Kapillarelektrophorese zur Analyse von fluoreszenzmarkierten PCR-Amplikons, die aus verschiedenen Proben gewonnen wurden, basierend auf ihrer Größe. Es erzeugt ein Migrationsmuster, das die Basenpaarlängen der Fragmente mit Hilfe des markierten Fluoreszenzfarbstoffs in jedem Fragment bestimmt.

Protokoll

>1. Aufbau der Kapillarelektrophorese und Laufbedingungen

1. Nach Bestätigung der PCR-Amplikone PCR-Produkte 1:10 (v/v) in gereinigtem Wasser verdünnen. Verschlingen, mischen und kurz zentrifugieren.
2. Bereiten Sie in einem Abzug ein Volumen Mastermix vor, das aus 9 μl Formamid und 0,5 μl Standardgröße pro PCR-Produkt besteht (erlauben Sie 10 % Überschussvolumen). Kurz vortexen und 9,5 μl auf einer für das verfügbare CE-System geeigneten Platte in Wells verteilen, bevor 0,5 μl verdünntes PCR-Produkt hinzugefügt werden. Verschliessen, mischen und kurz zentrifugieren.
   ACHTUNG: Mit Vorsicht behandeln. Beim Mischen von Formamid mit Wasser entsteht Ameisensäure, die giftig ist.
3. Mit einem PCR-Thermocycler werden die Proben 3 Minuten lang bei 95 °C denaturiert, bevor sie auf unbestimmte Zeit auf 4 °C abgekühlt werden. Kurz zentrifugieren und die Platte gemäß den Herstellerangaben auf ein kalibriertes CE-System laden.
4. Führen Sie die Fragmentanalyse CE mit Reagenzien durch, die für das Gerät Ihrer Wahl und die folgenden Einstellungen geeignet sind: 60 °C; 5 s Injektionen bei 1,6 kV (32 V pro cm); 32 min Laufzeit bei 15 kV (300 V pro cm). Die CE-Fragmentanalyse von 24 Vertiefungen auf einer 24-Kapillare (50 cm) dauert in der Regel etwa 50 Minuten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Avant 3500xL Genetischer Analysator	Thermo Fisher Scientific	Nr. A30469	Wird für die Analyse von Kapillarelektrophorese-Fragmenten verwendet.
GelRed Nukleinsäure-Färbung, 10.000X in Wasser	Biotium	Artikel-Nr.: 41003	Fluoreszierender Nukleinsäurefarbstoff, der bei der Gelelektrophorese verwendet wird.
GeneMapper Software 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Wird zum Ablesen von Elektropherogrammen aus der Kapillarelektrophorese verwendet.
GeneScan 600 LIZ Farbstoff Größe Standard v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Größenstandard, der bei der Kapillarelektrophorese verwendet wird.
Hi-Di Formamid	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Deionisiertes Formamid, das während der Kapillarelektrophorese verwendet wird. Arbeitsaliquouts vorbereiten.
Milli-Q Wasser	Na	Na	Gereinigtes Wasser, das während der PCR und Kapillarelektrophorese verwendet wird. Standardrezept; Im eigenen Haus produziert.
POP-7 Polymer für 3500 Dx/3500xL Dx Genetische Analysatoren	Thermo Fisher Scientific	Nr. A26077/4393713/4393709	Trennmatrix, die bei der Kapillarelektrophorese verwendet wird.
UV-basiertes Gel-Imaging-/Visualisierungssystem	Wie gewünscht.	Na
Vortexer	Wie gewünscht.	Na