Mikrofluidische Kapillarelektrophorese zur Fragmentgrößenbestimmung von PCR-Produkten: Eine mikrochipbasierte elektrophoretische Trenntechnik zur Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe

Zusammenfassung

Quelle: Wang, H., Zhu et al. Ein robuster Polymerase-Kettenreaktions-basierter Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen im Fragile X Mental Retardation-1 Gen. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt die mikrofluidische Kapillarelektrophorese-Technik, um PCR-Amplikons nach ihrer Größe zu trennen. Diese Technik hilft bei der Fragmentgrößenbestimmung unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen und Standardmarkern für die Molekülgröße.

Protokoll

>1. Fragmentgrößenbestimmung von PCR-Produkten

1. Lassen Sie vor dem Start das DNA-Farbstoffkonzentrat, die DNA-Gelmatrix, den DNA-Marker, die DNA-Leiter und die gereinigten DNA-Proben 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen.
2. Einrichten der Ansaugstation
   1. Ersetzen Sie die Spritze (siehe Materialtabelle), wenn Sie eine neue Charge von Reagenzien verwenden.
   2. Stellen Sie die Basisplatte ein, lassen Sie den Hebel des Spritzenclips los und schieben Sie ihn in die obere Position.
3. Starten Sie die Leimungssoftware (siehe Materialtabelle) und bereiten Sie die Gel-Farbstoff-Mischung vor.
4. Vortex-Färbekonzentrat für 10 s und herunterschleudern. Geben Sie 25 μl des Farbstoffs in ein Durchstechflasche mit Gelmatrix. Die gemischte Lösung gut einreiben und herunterschleudern.
   1. Übertragen Sie die Gel-Farbstoff-Mischung in einen Schleuderfilter. Den Schleuderfilter in eine Mikrozentrifuge geben und 10 min bei Raumtemperatur bei 1.500 x g ± 20 % schleudern.
      HINWEIS: Schützen Sie die Lösung mit Farbstoff vor Licht und lagern Sie sie nach Gebrauch bei 4 °C. Die Gel-Färbemischung kann nach der Zubereitung für ca. 15 Chips verwendet werden. Lassen Sie die Gel-Farbstoff-Mischung vor der Verwendung jeweils 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen.
5. Laden Sie die Gel-Farbstoff-Mischung
   1. Setzen Sie einen neuen DNA-Chip in die Priming-Station ein. Geben Sie 9 μl Gel-Farbstoff-Mischung in die mit "G" gekennzeichnete Vertiefung. Bitte stellen Sie sicher, dass sich der Kolben an der 1-ml-Markierung befindet, und schließen Sie dann die Ansaugstation.
   2. Drücken Sie den Spritzenkolben nach unten, bis er vom Clip gehalten wird. Warten Sie genau 30 s und lassen Sie dann den Clip los. Warten Sie 5 s und ziehen Sie dann den Kolben langsam wieder in die 1-ml-Position zurück.
   3. Öffnen Sie die Priming-Station und geben Sie 9 μl Gel-Farbstoff-Mischung in die mit "G" gekennzeichneten Vertiefungen.
6. Geben Sie 5 μl Marker in die mit dem Leitersymbol markierte Vertiefung und fügen Sie zusätzlich 5 μl Marker in jede der 12 Probenvertiefungen hinzu. Lassen Sie keine Vertiefungen leer.
7. Geben Sie 1 μl DNA-Leiter in die Vertiefung, die mit dem Leitersymbol gekennzeichnet ist. Geben Sie jeweils 1 μl PCR-Produkt (gebrauchte Vertiefungen) oder 1 μl Reinstwasser (unbenutzte Vertiefungen) in jede der 12 Probenvertiefungen. Setzen Sie den Chip horizontal für 1 min bei der angegebenen Einstellung (2.400 U/min) in den Adapter von Vortex-Mischer und Vortex ein.
8. Setzen Sie den Chip in das Bioanalysegerät ein und lassen Sie den Chip innerhalb von 5 Minuten in das Gerät einlaufen.
9. Entfernen Sie nach Abschluss des Assays sofort den gebrauchten Chip aus dem Gerät.
10. Geben Sie langsam 350 μl deionisiertes Wasser in eine der Vertiefungen des Elektrodenreinigers. Öffnen Sie den Deckel des Bioanalysators und legen Sie den Elektrodenreiniger hinein. Den Deckel schließen und ca. 10 s inkubieren. Öffnen Sie den Deckel und entfernen Sie den Elektrodenreiniger. Warten Sie weitere 10 Sekunden, damit das Wasser auf den Elektroden verdunsten kann, und schließen Sie dann den Deckel.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument: 0,2 mL PCR-Röhrchen	Axygen	PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument: 1x TE Puffer, pH 8,0, Rnase-frei	Ambion	AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument: 2100 Bioanalyzer Gerät	Agilent	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument: 96-Well-PCR-Platte	Thermo Fischer	AB0800
Agilent 2100 Bioanalysegerät: Elektrodenkartusche	Agilent		Liefert die Ausrüstung des Bioanalysegeräts 2100
Agilent 2100 Bioanalysegerät: IKA Vortex-Mischer	Agilent		Liefert die Ausrüstung des Bioanalysegeräts 2100
Agilent 2100 Bioanalysegerät: Software zur Dimensionierung 2100 Expert Software	Agilent		Liefert die Ausrüstung des Bioanalysegeräts 2100
Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument: Testchips	Agilent		Liefert die Ausrüstung des Bioanalysegeräts 2100
Agilent DNA 7500 Bausatz	Agilent	Tel.: 5067-1506	Für die Fragmentgrößenanpassung
Agilent DNA 7500 Kit: DNA 7500 Leiter (gelbe Kappe)	Agilent		Im Kit: Agilent DNA 7500 Kit (Katalognummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 Kit: DNA 7500 Marker (grüne Kappe)	Agilent		Im Kit: Agilent DNA 7500 Kit (Katalognummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 Kit: DNA-Chips	Agilent		Im Kit: Agilent DNA 7500 Kit (Katalognummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 Kit: DNA-Farbstoffkonzentrat (blaue Kappe)	Agilent		Im Kit: Agilent DNA 7500 Kit (Katalognummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 Kit: DNA-Gel-Matrix-Fläschchen (rote Kappe)	Agilent		Im Kit: Agilent DNA 7500 Kit (Katalognummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 Kit: Elektrodenreiniger	Agilent		Im Kit: Agilent DNA 7500 Kit (Katalognummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 Kit: Spin-Filter	Agilent		Lieferumfang des Agilent DNA 7500 Kits (Katalognummer: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 Kit: Spritze	Agilent		Lieferumfang des Agilent DNA 7500 Kits (Katalognummer: 5067-1506)
Span-Ansaugstation	Agilent	Tel.: 5065-4401	Liefert die Ausrüstung des Bioanalysegeräts 2100
Filterplatten-Vakuumverteiler: MultiScreenHTS Vakuumverteiler	Merck Millipore	MSVMHTS00	Vakuuminstrument für Filterplatten-Vakuum Verteiler für die PCR-Produktreinigung
Filterplatte Vakuum Verteiler: Silikonstopfen	Merck Millipore	XX2004718	Filterplatte Vakuum Verteiler
Filterplatte Vakuum Verteiler: Vakuumpumpe	Merck Millipore	WP6122050	Filterplatte Vakuum Verteiler
Filterplatte Vakuum Verteiler: Abfallsammelbehälter	Merck Millipore	XX1004705	Filterplatte Vakuum Verteiler