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>1. Blockieren von freien Cysteinresten mit Jodacetamid
- Züchten Sie U-2-OS-Zellen in einer 6 cm2 großen Schale auf 50 % bis 60 % Konfluenz in einem Minimum an essentiellem Medium mit hohem Glukosegehalt, der 10 % fötales Rinderserum und 1 % Natriumpyruvat bei 37 °C in 5 % CO2 enthält.
- Stellen Sie kurz vor der Verwendung einen frischen Vorrat von 10 mM Iodacetamid her und entsorgen Sie dann alle nicht verwendeten Reagenzien.
- Geben Sie 0,1 mM Endkonzentration Iodacetamid direkt in das Zellkulturmedium. Das Gericht bei Raumtemperatur 2 Min. leicht wiegen.
>2. Ernte der Zellen
- Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit 5 ml kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Aspirieren Sie die endgültige PBS-Waschlösung und fügen Sie dann 1 ml kaltes PBS hinzu.
- Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden der Schale ab. Ziehen Sie mit einer 1-ml-Pipette das PBS und die Zellsuspension auf und geben Sie die gesamte Flüssigkeit in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ab.
- Schleudern Sie die Zellen bei 7.500 x g für drei Minuten bei 4 °C. Aspirieren Sie das PBS und lassen Sie das Zellpellet zurück. Das Zellpellet kann bis zur Verarbeitung bei -80 °C gelagert werden
3. Extraktion von Protein
- Bereiten Sie 100 μl eines 1x Lysepuffers vor, verdünnt in ddH2O (siehe Materialtabelle). Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) unmittelbar vor Gebrauch bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugeben.
- 50 μL des 1x Lysepuffers direkt in das Zellpellet geben und suspendieren. Inkubieren Sie dies 5 Minuten lang auf Eis.
- Beschallung für 8 s mit dem konstanten Impulsmodus bei 40 % (siehe Materialtabelle für Ultraschallgerät; je nach Bedarf für verschiedene Ultraschallgeräte anpassen), wobei der Extrakt auf Eis gehalten wird.
- Schleudern Sie den Extrakt bei 4 °C für 5 min bei 16.000 x g. Der Überstand ist die lösliche Proteinfraktion. Auf Wunsch kann eine Bradford-Analyse durchgeführt werden, um die Proteinkonzentration zu bestimmen.
4. Probenvorbereitung
- Nehmen Sie 10 μL des löslichen Proteinextrakts und fügen Sie 10 μL eines 1x Laemmli SDS-Probenpuffers (4% SDS, 20% Glycerin, 0,004% Bromphenolblau und 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8) hinzu. Fügen Sie keine Reduktionsreagenzien hinzu.
- Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, wenn an diesem Tag eine SDS-PAGE-Analyse durchgeführt wird; für die Langzeitlagerung ist eine Temperatur von -20 °C geeignet. Erhitzen Sie die Probe unmittelbar vor dem Ausführen des Gels 5 Minuten lang auf 85 °C.
>5. In vivo Formaldehyd-Vernetzung von endogenen Proteinen in U-2 OS-Zellen
- Züchten Sie U-2 OS-Zellen in einem 175 cm2 Kolben mit einer Konfluenz von 70 % bis 80 %.
- Führen Sie die Formaldehyd-Vernetzungsreaktion durch
- Aliquotieren Sie in einem Abzug eine 37%ige Formaldehydlösung, die aus kommerziellen Quellen bezogen wurde. Das Formaldehyd-Fixiermittel bis zu einer Endkonzentration von 1 % direkt in das Medium geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.
- Um die Reaktion zu stillen, werden 1,25 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 M zugegeben und bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren auf einer Wippe 5 Minuten lang inkubiert.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit 5 ml kaltem PBS. Aspirieren Sie die endgültige PBS-Waschlösung und fügen Sie 10 ml PBS hinzu. Die Zellen werden mit einem Zellschaber vom Boden des Kolbens abgekratzt.
- Ziehen Sie mit einer 10-ml-Pipette das PBS und die Zellsuspension auf und geben Sie die gesamte Flüssigkeit in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen ab. Die Zellen bei 500 x g für 2 min bei 4 °C drehen. Das PBS aspirieren, dabei das Zellpellet zurücklassen.
>6. Fraktionierung von Kernen
- Bereiten Sie 10 ml Homogenisierungspuffer vor: 0,25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES und 0,5 % BSA bei pH 7,4. Unmittelbar vor Gebrauch PMSF bis zu einer Endkonzentration von 1 mM und 3 ml Kernsuspensionspuffer (0,1 % Triton X-100 in PBS) hinzufügen.
- Geben Sie 5 mL Homogenisierungspuffer direkt zum Zellpellet und suspendieren Sie es vollständig. Die Suspension wird bei 500 x g 2 min bei 4 °C zentrifugiert, dann wird der Überstand verworfen.
- Das Pellet wird in 5 ml Homogenisierungspuffer suspendiert. Verwenden Sie einen eng anliegenden Glas-Teflon-Homogenisator, homogenisieren Sie die Zellen bei 10 Hüben/500 U/min.
- Die Suspension wird bei 1.500 x g 10 min bei 4 ΰC zentrifugiert, dann wird der Überstand verworfen.
HINWEIS: Verwenden Sie den Überstand zur Isolierung von Mitochondrien, indem Sie 10 Minuten lang bei 10.000 x g zentrifugieren.
- Suspendieren Sie das Pellet in 1 mL Kernsuspensionspuffer und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis.
- Bei 600 x g 10 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
- Das Pellet in 1 mL Kernsuspensionspuffer suspendieren und erneut zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Das endgültige Pellet besteht aus isolierten Kernen.
>7. Extraktion von Protein
- Wiederholen Sie Abschnitt 4, mit der Ausnahme, dass Sie 25 μl des 1x-Lysepuffers direkt zum Zellpellet hinzufügen und dann suspendieren.
>8. Probenvorbereitung
- Bereiten Sie zwei Proben für SDS-PAGE vor, indem Sie jeweils 10 μl des löslichen Proteinextrakts entnehmen und 10 μl 2x Laemmli SDS-Probenpuffer und 1 μl 2-Mercaptoethanol (BME) hinzufügen.
- Eine Probe wird 5 min lang auf 37 °C und die zweite Probe 15 min lang auf 98 °C erhitzt, um die Formaldehyd-Vernetzung umzukehren.
9. SDS-PAGE Analyse
- Bereiten Sie 1 l 1x Tris-Glycin-Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % (w/v) SDS) vor.
- Richten Sie das SDS-PAGE-Laufgerät ein.
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet eine 16% vorgefertigte TGX SDS-Seite. Zu beachten ist, dass ein beliebiger Prozentsatz an Gel verwendet werden kann.
- Öffnen Sie gemäß dem Herstellerprotokoll die Verpackung, in der das Gel aufbewahrt wird, und entfernen Sie die Kassette.
- Entferne den Kamm, der die Vertiefungen auskleidet, und das Klebeband von der Unterseite der Kassette.
- Geben Sie das Gel in das Laufgerät.
- Füllen Sie die Kammer mit dem 1x Laufpuffer, bis die Vertiefungen in Flüssigkeit eingetaucht sind. Spülen Sie die Vertiefungen mit einer Kunststoffpipette mit dem Laufpuffer aus.
- Laden Sie die Proben zusammen mit 10 μl vorgefärbtem Standardmarker auf das Gel.
- Lassen Sie das Gel bei 200 V laufen, bis die Farbstofffront etwa 1 cm vom Boden des Gels entfernt ist.