Isoelektrische Fokussierung in der Flüssigphase: Eine Elektrophoresetechnik zur Trennung bioaktiver Moleküle aus rohem Gymnema sylvestre-Extrakt

Zusammenfassung

Quelle: Veerapandian, R., et al. Trennung von bioaktiven kleinen Molekülen, Peptiden aus natürlichen Quellen und Proteinen von Mikroben durch die Methode der präparativen isoelektrischen Fokussierung (IEF). J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video beschreibt eine Technik zur Trennung komplexer Moleküle aus Pflanzenextrakten mittels isoelektrischer Fokussierung in der flüssigen Phase. Diese Technik hilft dabei, komplexe Biomoleküle in ihrem nativen Zustand zu reinigen, die für verschiedene Downstream-Anwendungen verwendet werden können.

Protokoll

>1. Trennung und Reinigung von kleinen Molekülen und Peptiden aus Gymnema sylvestre-Extrakt

1. Messen Sie 0,6 g Pflanzenextrakt und lösen Sie ihn in destilliertem Wasser (60 mL) auf, indem Sie ihn in einem Rollrohr für 5 Min. mischen
   HINWEIS: Jede biologische Probe, die löslich und salzfrei ist, kann zur Trennung und Reinigung mit einem Flüssigphasen-Isoelektrischen Fokussierungsgerät (IEF) verwendet werden. Proben mit einer Puffersalzkonzentration von bis zu 10 mM können mit leicht verringerter Auflösung verwendet werden.
2. Zentrifugieren Sie den löslichen Pflanzenextrakt bei 10.000 x g für 5 Minuten, um unlösliche Partikel zu entfernen.
3. Übertragen Sie den Überstand (~60 mL) in ein 80 mL Zentrifugenröhrchen und mischen Sie es mit 0,6 mL Ampholyt (pH 3-10) bis 1% (v/v).
4. Bereiten Sie die IEF-Einheit für die Flüssigphase vor.
   1. Montieren Sie die IEF-Elektroden für die Flüssigphase (Anoden-roter Knopf und kathodenschwarzer Knopf) mit ihren jeweiligen Austauschmembranen gemäß der Bedienungsanleitung (Materialtabelle). Die Anionenaustauschermembranen mit 0,1 M NaOH und die Kationenaustauschermembranen mit 0,1 M H₃PO₄ sind bei Verwendung neuer Membranen mindestens für 16 h äquilibriert.
   2. Die Membranen zwischen den Durchläufen in Elektrolyten (0,1 M NaOH oder 0,1 M H₃PO₄) lagern und nicht austrocknen lassen.
   3. Montieren Sie den inneren und äußeren Teil der Elektrode, indem Sie drei längliche Löcher in den Ionenaustauscherdichtungen ausrichten. Füllen Sie die Elektroden mit den entsprechenden Elektrolyten (~25-30 mL), um ein Austrocknen der Membranen zu verhindern.
   4. Fügen Sie keinen überschüssigen Elektrolyten (mehr als 1/3 des Volumens der Elektrodenkammer) hinzu, der den Druck in der Elektrode aufbauen und Leckagen verursachen kann.
   5. Decken Sie die Probenentnahmeöffnungen mit Dichtungsband ab, das mit den Montageteilen des Instruments geliefert wird (Materialtabelle). Die Seite der Probenentnahmeanschlüsse ist an den beiden vertikalen Ausrichtungsstiften aus Metall zu erkennen. Alternativ können Sie Standard-Dichtungsband verwenden, um die Anschlüsse abzudichten.
   6. Montieren Sie alle Teile der Fokussierkammerbaugruppe nacheinander (Anodenelektrode, Nylonmembrankern, Fokussierkammer und Kathodenelektrode) über dem keramischen Kühlfinger.
   7. Füllen Sie die Fokussierkammer mit vorgekühltem destilliertem Wasser (Gesamtvolumen von 60 mL für die Standard-IEF-Zelle) mit einer 50-ml-Spritze.
   8. Schließen Sie das Flüssigphasen-IEF-Gerät an ein zirkulierendes Kühlwasser mit einer Temperatur von 4 ºC an und lassen Sie das Gerät 3-5 Minuten lang oder bis zur Stabilisierung der Spannung mit 15 W und 3.000 V vorlaufen.
      HINWEIS: In der Regel erreicht die Spannung innerhalb einer Minute die maximal eingestellten Werte. Das Vorlaufen mit destilliertem Wasser hilft, die Restionen aus der Fokussierkammer und dem Nylonmembrankern zu entfernen.
   9. Schalten Sie die Stromquelle aus und entfernen Sie das Wasser mit dem Fraktionssammler aus der Zelle. Verschließen Sie die Auffangöffnungen wieder mit Dichtband. Die Kammer ist nun bereit, die Probe zu laden.
5. Verwenden Sie eine 50-ml-Spritze mit einer 1-1/2-Zoll-Nadel mit stumpfem Ende (im Lieferumfang des Instruments enthalten) und laden Sie die vorbereitete Probe mit Ampholyt (insgesamt 60 mL) durch die Probenentnahmeöffnungen in die Zelle.
6. Entfernen Sie Luftblasen aus der Probenzelle, indem Sie die Fokussierzelle vom Stativ entfernen und auf die Elektrodenkammer klopfen, um die Blasen zu entfernen. Das Vorhandensein von Luftblasen führt zu Spannungs- und Stromschwankungen und beeinträchtigt den Lauf.
7. Schließen Sie das Gerät an das Kühlwasser (4 °C) an und starten Sie die Fraktionierung mit dem Netzteil bei konstanten 15 W.
8. Lassen Sie das Gerät 3 h lang laufen oder bis die Spannung einen konstanten Wert erreicht.
   HINWEIS: Wenn die Probe mit der Fokussierung beginnt, beginnt die Spannung allmählich zu steigen, bis sie einen konstanten Wert erreicht.
9. Bereiten Sie nach dem Lauf das Sammeln der Fraktionen in der Erntebox (mit 20 Kunststoffröhrchen, 12 mm x 75 mm, 5-6 mL Volumen) vor, die an die Vakuumpumpe angeschlossen ist, indem Sie die Erntetaste ON in der IEF-Einheit drücken.
10. Richten Sie die 20-Sammelstifte an den 20-Sammelanschlüssen der Fokussierzelle aus, die mit dem Klebeband abgedichtet ist.
11. Schieben Sie die Auffangstifte durch das Dichtungsband und schalten Sie die Vakuumpumpe gleichzeitig ein (Abbildung 1B, 1C und 1D).
    HINWEIS: Jedes Mal werden etwa 3 ml-Fraktionen aus jeder Kammer in den Röhrchen gesammelt. Die Fraktionen können für nachfolgende Downstream-Anwendungen verwendet werden (SDS-PAGE für die Peptidquantifizierung, DC- und Bioassay für kleine Moleküle).

Ergebnisse

Abbildung 1: Aufbau der Flüssigphasen-IEF-Apparatur und Fraktionierung von G. sylvestre-Pflanzenextrakt. (A) Während des Laufs, (B) während der Fraktionssammlung, (C) nach der Fraktionssammlung und (D) Flüssigphasen-IEF-Geräteteile, 1) Ionenaustauschmembranen, 2) Fokussierkammer und Membrankern, 3) Elektrodenanordnung (negativ), 4) Elektrodenanordnung (positiv).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,45 μm Spritzenvorsatzfilter	Fisher wissenschaftliche Arbeit	Tel.: 09-720-004
Bio-Lyte 3/10 Ampholyt	Bio-Rad	Tel.: 163-1113
Bio-Lyte 5/8 Ampholyt	Bio-Rad	Nr. 163-1192
Kompaktes Niedertemperatur-Thermostat	Lauda -Brinkmann	RM 6T	Stellen Sie die Wasserkühlung auf 4 °C ein und sie kann sogar bei 0 °C betrieben werden, da die Temperatur des zirkulierenden Wassers je nach Spannung bei etwa 5 °C liegt, wenn sie durch den Rotofor-Kühlkern geleitet wird.
Gymnema Pflanzenblattextrakt Pulver (>25% Gymnemischsäuren)	Suan Farma, NJ USA
Mini-Proteus-Elektrophorese	Bio-Rad
pH-Messgerät	Mettler Toledo	Nr. S20	Nützlich zur Bestimmung des pH-Werts der Rotofor-Fraktionen (Flüssigphasen-IEF)
Rotofor	Bio-Rad	Tel.: 170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Bedienungsanleitung für den Zusammenbau des Geräts)
RPMI-1640 Mittel	HyClone	DH30255.01
Dichtband	Bio-Rad	Tel.: 170-2960	Es kann auch Klebeband verwendet werden
Sorvall legend micro 17 Zentrifuge	Thermowissenschaftlich	75002432