Mobilitätsverschiebung Affinitätskapillarelektrophorese: Eine Methode zur Analyse von Proben-Liganden-Wechselwirkungen in Abhängigkeit von der differentiellen Migration von Protein-Liganden-Komplexen

Abstract

Quelle: Nachbar M. et al., Analyse der intrinsischen AtHIRD11-Störung und Bindung an Metallionen durch Kapillargelelektrophorese und Affinitätskapillarelektrophorese. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt die Methode zur Analyse der Protein-Liganden-Interaktion durch Mobilitätsverschiebungs-Affinitäts-Kapillarelektrophorese. Diese Methode kann verwendet werden, um das Bindungsverhalten eines Proteins mit verschiedenen geladenen Liganden zu charakterisieren.

Protocol

>1. Bereiten Sie die Lösungen für die ACE-Analyse vor

1. Bereiten Sie die 1 M NaOH-Lösung vor.
   1. 4,0 g NaOH werden in einem 100-ml-Messkolben gewogen.
   2. Füllen Sie es bis zur Markierung mit entionisiertem Wasser, um eine 1 M Brühe zu erhalten.
2. Bereiten Sie die 0,1 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einer 0,1 M NaOH-Lösung vor.
   1. 10 ml 0,1 M NaOH werden mit einer 10-ml-Kolbenpipette in einen 100-ml-Messkolben überführt. Füllen Sie es bis zur Markierung mit entionisiertem Wasser.
   2. Wiegen Sie 2,42 g EDTA auf einer Waage und lösen Sie die feste Verbindung in den 100 mL von 0,1 M NaOH auf.
3. Bereiten Sie die Tris-Pufferlösung (30 mM) vor.
   1. 3,63 g Tris, 200 ml entionisiertes Wasser und einen Rührstab in ein 500-ml-Becherglas geben. Stellen Sie den Becher auf eine Rührplatte und schalten Sie ihn ein.
   2. Legen Sie eine pH-Messelektrode in das Becherglas und stellen Sie den pH-Wert mit 0,1 M HCl auf 7,4 ein.
   3. Die Lösung wird in einen 1-l-Messkolben gefüllt und bis zur Markierung mit entionisiertem Wasser aufgefüllt.
      HINWEIS: Dieser Vorgang muss wiederholt werden oder es wird ein größerer Messkolben benötigt, da für die gesamte Analyse mehr als 1 l benötigt wird.
4. Bereiten Sie die Acetanilid-Elektroosmosefluss-Markerlösung (60 μM) vor.
   1. 6 mg Acetanilid und 100 ml Tris-Puffer werden in einen 100-ml-Messkolben gegeben.
   2. Legen Sie den Messkolben in ein Ultraschallbad und schalten Sie ihn für 30 min ein.
5. Bereiten Sie die Probenlösung (1 mg/ml) vor.
   1. Legen Sie ein 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf eine Präzisionswaage und geben Sie 0,3 mg gefriergetrocknetes AtHIRD11-Pulver in das Röhrchen.
   2. Verwenden Sie eine Mikropipette, um 0,3 ml eines 30 mM Tris-Puffers (pH 7,4) in das Röhrchen zu geben. Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig, um das Protein aufzulösen.
6. Bereiten Sie die Ligandenlösungen vor.
   1. Bereiten Sie die CaCl₂ (5 mM) Stammlösung vor.
      1. Nehmen Sie ein Wägeschiffchen, stellen Sie es auf eine Analysenwaage und wiegen Sie 36,76 mg CaCl₂*H₂O.
      2. Spülen Sie mit einer Mikropipette das CaCl₂*H₂O aus dem Wägeschiffchen in einen 50-ml-Messkolben mit dem zuvor vorbereiteten Tris-Puffer.
      3. Der Messkolben wird bis zur Markierung mit dem Tris-Puffer gefüllt.
   2. Bereiten Sie die restlichen Stammlösungen (5 mM) vor.
      1. Schritt 1.6.1 wiederholen und die anderen Metallsalze anstelle von CaCl₂*H₂O [MgCl₂: 23,80 mg, BaCl₂: 26,02 mg, Sr(NO₃)₂: 52,91 mg, MnCl₂: 31,46 mg, SeCl₄: 52,91 mg, CoCl₂*2H₂O: 41,47 mg, CuCl₂*2H₂O: 42,62 mg, ZnCl₂: 3,41 mg und NiCl₂*6H₂O: 59,43 mg],
         Anmerkung: Die ZnCl_2-Lösung hat eine Konzentration von 0,5 mM. Da starke Wechselwirkungen zwischen den Ionen und der inneren Kapillarwand beobachtet wurden, wurde die Konzentration um den Faktor 10⁴ reduziert.
   3. Bereiten Sie die 500 μM CaCl_2-Lösung vor.
      1. Füllen Sie 10 mL der CaCl_{2-Stammlösung} ab und geben Sie sie in einen 100-ml-Messkolben.
      2. Der Messkolben wird bis zur Markierung mit einem Tris-Puffer gefüllt und der Kolben wird geschüttelt.
   4. Bereiten Sie die 250 μM CaCl_2-Lösung vor.
      1. Füllen Sie 5 ml der CaCl 2-Stammlösung ab und geben Sie sie in einen 100-ml-Messkolben
      .
      2. Der Messkolben wird bis zur Markierung mit einem Tris-Puffer gefüllt und der Kolben wird geschüttelt.
   5. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte für die anderen Stammlösungen.
7. Füllen Sie die Lösungen in die Fläschchen.
   Anmerkung: Bei jedem wiederholten Durchlauf wird ein Satz Einlass- und Auslassfläschchen benötigt. Die Verwendung frischer Ligandenlösungen am Einlass und Auslass reduziert die Verschiebungen der Migrationszeit nach jedem Lauf.
   1. Füllen Sie die 250 μM CaCl_2-Lösung in eine 10 mL Spritze.
   2. Setzen Sie einen 0,22 μm PVDF-Filter auf die Spritze und drücken Sie 2 mL der Lösung mit der Spritze durch den Filter, um diese gefilterte Lösung zu verwerfen.
   3. Füllen Sie 10 Fläschchen bis zum maximal zulässigen Volumen mit den restlichen 250 μM CaCl_2-Lösung der Spritze. Markieren Sie jedes Fläschchen als 250 μM CaCl 2-Lösungseinlassfläschchen.
   4. Füllen Sie 10 Durchstechflaschen, bis sie zur Hälfte mit der 250 μM CaCl_2-Lösung gefüllt sind. Markieren Sie jedes Fläschchen als 250 μM CaCl 2-Lösungsauslassfläschchen.
   5. Die Schritte 1.7.1 - 1.7.4 für die anderen metallsalzhaltigen Lösungen wiederholen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte für jedes Paar Einlass- und Auslassfläschchen mit der 30 mM Tris-Pufferlösung (pH 7,4).
      Anmerkung: Der 30 mmol/L Tris-Puffer pH 7,4 wird zwischen den Durchläufen verwendet, um Daten zur Migrationszeit für das Protein in Abwesenheit von Metallionen zu erhalten. Es ist notwendig, Änderungen im EOF zu vernachlässigen.
   7. Wiederholen Sie die obigen Schritte für eine Durchstechflasche mit der Acetanilid-EOF-Marker-Lösung (60 μM). Wiederholen Sie diese Schritte auch mit der Probenlösung (1 mg/ml).

>2. Affinitätskapillar-Elektrophoretische Analyse

1. Konditionieren Sie die Kapillare
   1. Stellen Sie das Thermostat auf 23 °C ein.
      Anmerkung: Die Temperatur wird gemäß den veröffentlichten Protokollen verwendet und kann auf andere Temperaturen geändert werden. Die Wechselwirkungen sind jedoch von der Temperatur abhängig und werden sich entsprechend ändern.
   2. Spülen Sie eine Kapillare für 40 min bei 2,5 bar mit 0,1 M NaOH.
   3. Spülen Sie die Kapillare 10 min lang bei 1,0 bar mit entionisiertem Wasser.
   4. Spülen Sie die Kapillare 30 min lang bei 1,0 bar mit einem 30 mM Tris-Puffer (pH 7,4).
2. Vorbereitung auf die ACE-Methoden
   1. Bereiten Sie die Methode für die Messungen ohne Liganden vor.
      Anmerkung: Acetanilid wurde der Probenlösung nicht zugesetzt, da es 2 Proteinpeaks verschleiert.
      1. Spülen Sie die Kapillare 1 Minute lang bei 2,5 bar mit einer 0,1 M EDTA-Lösung.
      2. Spülen Sie die Kapillare 1 Minute lang bei 2,5 bar mit entionisiertem Wasser.
      3. Spülen Sie die Kapillare 1,5 Minuten lang bei 2,5 bar mit einem Tris-Puffer zur Äquilibrierung.
      4. Injizieren Sie die Acetanilidlösung 6 s lang bei 0,05 bar und wechseln Sie die Einlass- und Auslassfläschchen gegen die Tris-Pufferfläschchen.
      5. 0,05 bar für 2,4 s auftragen, um die Acetanilidlösung von der Spitze der Kapillare weiter nach innen zu drücken.
      6. Legen Sie 10,0 kV für 6 min an und detektieren Sie den Acetanilid-Peak bei einer Wellenlänge von 200 nm.
      7. Die Schritte 2.2.1.1. - 2.2.1.6. mit der Proteinprobe anstelle der Acetanilidlösung wiederholen und alle Proteinpeaks nachweisen.
   2. Bereiten Sie die Methode für die Messungen mit Liganden vor.
      1. Spülen Sie die Kapillare 1 Minute lang bei 2,5 bar mit einer 0,1 M EDTA-Lösung.
      2. Spülen Sie die Kapillare 1 Minute lang bei 2,5 bar mit entionisiertem Wasser.
      3. Spülen Sie die Kapillare 1,5 Minuten lang bei 2,5 bar mit der Ligandenlösung zur Äquilibrierung.
      4. Die Acetanilidlösung wird 6 s lang bei 0,05 bar injiziert und die Einlass- und Auslassfläschchen durch ligandenhaltige Pufferfläschchen ersetzt.
      5. 0,05 bar für 2,4 s auftragen, um die Acetanilidlösung von der Spitze der Kapillare weiter nach innen zu drücken.
      6. Legen Sie 10,0 kV für 6 min an und detektieren Sie den Acetanilid-Peak bei einer Wellenlänge von 200 nm.
      7. Die Schritte 2.2.2.1 - 2.2.2.6 mit der Proteinprobe anstelle der Acetanilidlösung wiederholen und alle Proteinpeaks nachweisen.
   3. Die Schritte 2.2.1 und 2.2.2 werden abwechselnd wiederholt, um die Änderung der Ladungsgrößenverhältnisse für die verschiedenen Protein-Metall-Ionen-Wechselwirkungen zu berechnen.
      1. Wechseln Sie die Proteinlösung alle 60 h gegen eine frische.
         Anmerkung: An dieser Stelle kann das Experiment pausiert werden. Dieses Verfahren wird mindestens 10x für jede Konzentration der Liganden wiederholt, da das Peakmuster von Lauf zu Lauf leicht variiert. Wird die Lösung länger als 60 h verwendet, werden die Schwankungen zu groß.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AtHIRD11-Probe	Shizuoka Universität (Gruppe Prof. M. Hara)		Dehydrin-Protein aus Arabidopsis thaliana, exprimiert in Escherichia coli
Barefused Kieselsäure-Kapillare,	Polymicro Technologies (Phoenix, USA)	Artikel-Nr.: 106815-0017	TSP050375 50 μm Innendurchmesser, 363 μm Außendurchmesser, Polyimid-Beschichtung
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Deutschland)		Instrument für Kapillarelektrophorese; Agilent 7100 CE kann stattdessen verwendet werden
Pipette für Kolben 25 mL	Duran Group GmbH (Mainz, Deutschland)	Tel.: 24 338 14	Vorbereitung der Ligandenlösung
Duran Glas-Messkolben 25 mL	Duran Group GmbH (Mainz, Deutschland)	Tel.: 24 671 1457	Vorbereitung der Liganden-Stammlösung
Duran Glas-Messkolben 10 mL	Duran Group GmbH (Mainz, Deutschland)	Tel.: 24 671 1054	Vorbereitung der Liganden-Stammlösung
Acetanilid	Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland)	397229-5G	Elektroosmotischer Strömungsmarker
Mangan(II)-chlorid	Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland)	Artikel-Nr.: 13217	Ligand
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland)	Artikel-Nr.: 431788-100G	Zutat zum Spülen
Bariumchlorid	Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland)	202738-5G	Ligand
Nickel(II)-chlorid-Hexahydrat	Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland)	Artikel-Nr.: 654507-5G	Ligand
Selen(IV)-chlorid	Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland)	323527-10G	Ligand
2-Amino-2-hydroxymethylpropan-1,3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland)	Artikel-Nr.: 252859-100G	Puffer-Zutat
Zink(II)-chlorid	Merck Millipore ( Darmstadt, Deutschland)	1088160250	Ligand
Strontiumnitrat	Merck Millipore ( Darmstadt, Deutschland)	1078720250	Ligand
Calciumchlorid-Dihydrat	Merck Millipore ( Darmstadt, Deutschland)	1371015000	Ligand
Kupfer(II)-chlorid-Dihydrat	Riedel-de Haën (Seelze, Deutschland)	Artikel-Nr.: 31286	Ligand
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Deutschland)	Nr. G2070-91126	Softwarepakete zur Bedienung der CE-Instrumente, zur Datenerfassung und -auswertung