Zymographie-Gelelektrophorese: Eine elektrophoretische Technik zum Nachweis von Matrix-Metalloproteinasen durch Bewertung der enzymatischen Aktivität

Zusammenfassung

Quelle: Hu, X. et al., Nachweis von funktionellen Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie. J. Vis. Exp. (2010)

Dieses Video demonstriert die Zymographie-Gelelektrophorese-Technik zur Beurteilung der Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die in Zellkulturüberständen vorhanden sind. Die aktiven MMPs bauen das MMP-spezifische Substrat ab, das in ein Polyacrylamidgel eingebettet ist, das nach der Färbung als klare Banden auf einem dunklen gefärbten Hintergrund erscheint.

Protokoll

>1. Laden und Ausführen des Gels

1. Alle Proben müssen angemessen vorbereitet werden, um die Funktion der Enzyme zu erhalten, und sofort nach der Entnahme verwendet oder gefroren bei -80 °C gelagert werden. Die Proben dürfen keine Reduktionsmittel (wie z. B. β-Mercaptoethanol) enthalten oder vor der Gelbeladung gekocht werden.
2. Öffnen Sie den Beutel mit einem Gel in einer Kassette und spülen Sie die Kassette mit entionisiertem Wasser aus.
   1. Entfernen Sie das Schutzband von der Unterseite der Kassette und den Kamm von der Oberseite des Gels.
   2. Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit Laufpuffer (in entionisiertem Wasser auf 1X verdünnt).
   3. Geben Sie das Gel in die Mini-Zelle und achten Sie darauf, dass die kleinere Seite der Kassette nach innen zeigt. Mit dem Gel Tension Wedge einrasten. Die Mini-Cell ermöglicht es, ein oder zwei Gele parallel laufen zu lassen.
   4. Füllen Sie die obere (innere) Kammer mit 1X Laufpuffer über dem Well-Niveau und prüfen Sie, ob es Undichtigkeiten gibt. Bei Undichtigkeiten den Puffer entfernen und das Gel neu positionieren.
   5. Füllen Sie die untere Kammer mit 1x Laufpuffer.
3. Laden Sie 10 μl molekularen Proteinmarker in eine Vertiefung.
   1. Mischen Sie die gleiche Menge des Gel-Ladepuffers und der Probe und laden Sie sie in die Vertiefungen des Gels mit Gel-Ladespitzen (die zwischen jeder Probe gewechselt werden). Diese Wells können mit insgesamt bis zu 20 μl beladen werden.
4. Setzen Sie den Deckel auf die Mini-Cell und schließen Sie die Elektrodenkabel an die Stromversorgung an. Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie es so ein, dass es 90 Minuten lang konstant mit 125 V läuft. Überprüfen Sie die Bildung kleiner Blasen auf dem Draht der unteren Kammer, die auf den Stromfluss hinweisen.
5. Wenn Sie Ihr erstes Gel verwenden, überwachen Sie den Fortschritt der Migration alle 15 Minuten, wobei Sie das im Ladepuffer enthaltene Bromphenolblau als Indikator verwenden. Lassen Sie das Gel laufen, bis der Indikatorfarbstoff den Boden des Gels erreicht.

2. Renaturierung und Entwicklung des Gels

1. Bereiten Sie für jedes Gel 100 ml 1X Renaturierungspuffer und 200 ml Denaturierungspuffer vor, beide in deionisiertem Wasser.
2. Wenn der bromophenolblaue Tracking-Farbstoff den Boden des Gels erreicht, schalten Sie die Stromversorgung aus, öffnen Sie die Mini-Cell und entfernen Sie das Gel. Trennen Sie die beiden Seiten der Kassette mit dem Gelmesser (oder einem Wiegespatel). Schneide eine Ecke aus, um die Richtung des Gels zu markieren.
3. Nehmen Sie das Gel vorsichtig aus der Kassette und geben Sie es in ein Gefäß mit 100 mL Renaturierungspuffer. 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.
4. Entfernen Sie den Renaturierungspuffer und fügen Sie dem Gel 100 mL Entwicklungspuffer hinzu. 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.
5. Entfernen Sie den Entwicklungspuffer und fügen Sie dem Gel weitere 100 ml Entwicklungspuffer hinzu. Über Nacht (16-18 Stunden) bei 37°C inkubieren.
6. Entfernen Sie den Entwicklungspuffer und spülen Sie ihn dreimal (jeweils 5 Minuten) mit entionisiertem Wasser unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur ab.
7. Scannen Sie das Gel, um die genaue Positionierung der Proteinstandardbanden zu speichern, da diese nach der Gelfärbung weniger oder nicht mehr sichtbar sind.
8. Färben Sie das Gel, indem Sie dem Gel 20 ml SimplyBlue Safestain hinzufügen. 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.
9. Entfernen Sie den SimplyBlue SafeStain und entfärben Sie das Gel in 100 mL oder mehr deionisiertem Wasser für eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
10. Für bessere Ergebnisse durch frisches entionisiertes Wasser ersetzen und eine weitere Stunde oder länger bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Xcell SureLock Mini-Cell Elektrophoresegerät mit CE-Kennzeichnung	Invitrogen	EI0001
Netzteil (Modell 302)	VWR	93000-744
Novex 10 % Gelatine-Zymogramm-Gele, 1,0 mm, 12 Vertiefungen	Invitrogen	EC61752BOX
Blue Juice Gel-Ladepuffer	Invitrogen	10816015
Tipps zum Laden von Gel	VWR	Tel.: 53509-015
Standard für das Molekulargewicht von Proteinen	Invitrogen	LC5800
Novex Tris-Glycin-SDS Laufpuffer	Invitrogen	Nr. LC2675
Novex Zymogramm Renaturierungspuffer	Invitrogen	LC2670
Novex Zymogramm zur Entwicklung von Puffer	Invitrogen	Nr. LC2671
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060