Dot-Blot-Assay zur Quantifizierung des viralen Genoms

HINWEIS: Rezepte für die Lösungen und Puffer, die für dieses Protokoll benötigt werden, finden Sie in Tabelle 1.

1. Punktfleck

1. Erstellung von Plasmid-DNA-Standards
   1. Verdünnen Sie die Plasmid-DNA des AAV-Vektorgenoms auf 10 ng/μl in Wasser oder Tris-HCl-Puffer (10 mM, pH 8,0). Nehmen Sie 25 μl dieser Verdünnung und verdauen Sie sie mit einem geeigneten Restriktionsenzym für 1 h, um die Plasmid-DNA in einem Reaktionsvolumen von 50 μl zu linearisieren.
      Anmerkung: Wir führen einen duplizierten Verdauungstrakt durch (siehe Schritt 1.4.1). Das geeignete Enzym sollte eines sein, das die Plasmid-DNA außerhalb der Dot-Blot-Sondenbindungsregion schneidet. Der Einfachheit halber kann die verdünnte Plasmid-DNA aliquotiert (25 μl/Röhrchen) und gefroren bei -20 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden. Verdauen Sie die Plasmid-DNA, während die Röhrchen in Schritt 5.1 zittern. Überverdauen Sie den Plasmid-DNA-Standard nicht.
   2. Geben Sie 450 μl Wasser oder TE in das Röhrchen mit dem verdauten Plasmid-DNA-Standard und mischen Sie es gründlich. Übertragen Sie 70 μl dieser Mischung in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1.330 μl Wasser oder TE, um einen verdünnten Plasmidstandard (25 pg/μl) herzustellen.
   3. Befolgen Sie Tabelle 1, um einen Satz von zweifachen seriellen Verdünnungen (600 μl/Röhrchen) zu erstellen. Mischen Sie die Verdünnungen gründlich, indem Sie sie 5 s lang vortexen lassen.
2. Denaturierung von Standards und viralen DNA-Proben
   1. Fügen Sie 600 μl 2x alkalische Lösung zu jeder Standardverdünnung hinzu. Gut mischen, indem Sie 5 bis 10 s vortexen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Geben Sie 120 μl 2x alkalische Lösung zu jeder viralen DNA-Probe. Gut mischen, indem Sie 5 bis 10 s vortexen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Einrichten des Dot-Blot-Geräts
   1. Schneiden Sie mit einer Schere eine Blotting-Membran (z. B. Zeta-Sonde) auf eine für die Anzahl der Proben und Standards geeignete Größe zu. Weichen Sie die Membran 10 Minuten lang mit Wasser ein, bevor Sie sie auf ein Dot-Blot-Gerät legen. Decken Sie ungenutzte Vertiefungen auf der Membranapparatur ab.
      Anmerkung: Fassen Sie die Membran mit einer sauberen Pinzette an. Zum Abdecken leerer Vertiefungen kann die hellblaue Schutzfolie verwendet werden, die mit der Membran geliefert wird. Lassen Sie die Membran nicht trocknen, bevor Sie Proben und Standards binden. Weitere Einzelheiten zur Montage und Verwendung des Gerätes finden Sie in der Bedienungsanleitung.
   2. Geben Sie Wasser in die Vertiefungen, in die die Proben geladen werden. Wenden Sie ein Vakuum an und ziehen Sie Wasser durch die Vertiefungen, um nach Fehlern zu suchen und nach Behebung erneut zu testen. Ziehen Sie die Schrauben unter Anwendung des Vakuums wieder fest, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten.
      Anmerkung: Eine unvollständige Abdichtung kann zu einem Leck von Proben zwischen den Bohrlöchern führen.
   3. Sobald das Wasser vollständig durchgezogen ist, lassen Sie das Vakuum vollständig los (d. h. der Vakuumverteiler sollte für den Luftdruck geöffnet sein).
4. Laden von Standards und Proben in das Dot-Blot-Gerät
   1. Tragen Sie 400 μl jedes verdünnten Plasmid-DNA-Standards auf jedes Well auf und führen Sie vier Spuren mit Standardverdünnungen durch. Verwenden Sie zwei separate Aliquots des Standard-Digests, und laden Sie jedes in doppelter Ausführung. 200 μl/Vertiefung jeder viralen DNA-Probe auftragen.
      Anmerkung: Unter Verwendung der verbleibenden ~40 μl denaturierter Proben können verdünnte Proben hergestellt werden (z. B. 10-fach verdünnte Proben mit 20 μl der Probe plus 180 μl 1x alkalische Lösung) und bei Bedarf abgetupft.
   2. Wenden Sie ein sanftes Vakuum an, um die DNA-Lösungen durch die Vertiefung zu ziehen.
      Anmerkung: Der Vakuumdruck muss durch teilweises Öffnen eines Dreiwegeventils eingestellt werden, so dass der Vakuumdruck sowohl auf das Dot-Blot-Gerät als auch auf die Atmosphäre ausgeübt wird (d. h. mit den Absperrarmen in einem Winkel von etwa 45°, wo sie ein lauteres Sauggeräusch erzeugen).
   3. Sobald alle Vertiefungen geleert sind, lassen Sie das Vakuum ab, indem Sie das Dreiwegeventil einstellen. Geben Sie 400 μl 1x alkalische Lösung in jede Vertiefung, die Standards und Proben enthält. Warten Sie 5 Minuten, bevor Sie das Vakuum erneut anwenden, um die Vertiefungen zu leeren.
   4. Wenden Sie das Vakuum auf die gleiche Weise erneut an.
   5. Zerlegen Sie das Dot-Blot-Gerät unter dem Vakuum, entfernen Sie die Membran und spülen Sie sie mit 2x SSC ab. Legen Sie die Membran mit der DNA-gebundenen Seite nach oben auf ein sauberes Papiertuch, um überschüssiges 2x SSC zu entfernen.
   6. Die geplottete DNA wird mit einem geeigneten UV-Vernetzer an die Membran UV-vernetzt, die Membran ist nun bereit für die Hybridisierung.
      Anmerkung: Für die UV-Vernetzung können Nassmembranen verwendet werden. Die getrockneten, UV-vernetzten Membranen können bei Raumtemperatur gelagert werden. Weitere Informationen finden Sie in der Werkstofftabelle.

2. Hybridisierung und Waschen

1. Erwärmen Sie den Hybridisierungspuffer in einem 65 °C heißen Wasserbad.
2. Markieren Sie eine DNA-Sonde enzymatisch mit radioaktivem ^α-32P dCTP und reinigen Sie sie mit handelsüblichen Kits gemäß der Empfehlung des Herstellers.
   Anmerkung: Wir verwenden eine Sonde von 0,5–2,0 kb Länge aus einer Enhancer-Promotor-Region oder einer proteinkodierenden Sequenz im viralen Genom. Obwohl dieses Protokoll ³²P-markierte radioaktive Sonden zur Signaldetektion verwendet, können auch nicht-radioaktive Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzsonden verwendet werden (siehe Abschnitt Diskussion).
3. Legen Sie die Membran mit der DNA-gebundenen Seite nach oben in eine Hybridisierungsflasche, spülen Sie die Membran mit 5 ml vorgewärmtem Hybridisierungspuffer ab und entsorgen Sie den Puffer. Fügen Sie dann 10 ml vorgewärmten Hybridisierungspuffer hinzu und stellen Sie die Flasche in einen rotierenden Hybridisierungsofen, der auf 65 °C eingestellt ist. Drehen Sie ≥5 Minuten lang.
4. 20 μl 10 mg/ml geschorene DNA-Lösung von Herings- oder Lachsspermien und die ³²P-markierte Sonde (≥10,⁷ cpm) 5 Minuten lang hitzedenaturieren, indem die Röhrchen auf einen auf 100 °C eingestellten Heizblock gelegt werden. Dann ≥2 Minuten auf Eis kalt stellen, kurz drehen und bis zur Verwendung auf Eis legen.
   Vorsicht: Für radioaktive DNA-Sonden müssen 1,5-ml-Röhrchen mit Schraubverschlüssen und O-Ringen verwendet werden.
5. Geben Sie schnell die denaturierte Spermien-DNA und die radioaktive Sonde in den Hybridisierungspuffer in der Hybridisierungsflasche und schütteln Sie die Flasche 10 s lang, um sie zu mischen. Stellen Sie die Flasche wieder in den 65 °C Ofen und inkubieren Sie die Flasche bei 65 °C für ≥4 h.
6. Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, stoppen Sie die Rotation, entfernen Sie die Hybridisierungsflasche und gießen Sie dann die radioaktive Sondenlösung in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit einer auslaufsicheren Verschlusskappe. Lagern Sie die Sonde in einem geeigneten Behälter, der in einem für radioaktive Stoffe bestimmten Kühlschrank aufgestellt ist.
   Anmerkung: Gebrauchter Hybridisierungspuffer mit einer Sonde, die bei 4 °C gelagert wird, kann mindestens 5 Mal wiederverwendet werden, indem der konische 50-ml-Schlauch mit einer auslaufsicheren Verschlusskappe, der den Hybridisierungspuffer enthält, für 5 Minuten in ein 100 °C-Wasserbad gelegt wird.
7. Waschen Sie die Membran mit einem auf 65 °C erhitzten Waschpuffer. Geben Sie 20 bis 30 ml Waschpuffer in die Hybridisierungsflasche und drehen Sie sie 5 Minuten lang. Wiederholen Sie diese Wäsche noch 2 Mal.
   Anmerkung: Messen Sie die Radioaktivität von Waschlösungen und erfassen Sie sie, wenn dies vom örtlichen Institut verlangt wird.
8. Legen Sie während des Waschens der Membran einen Phosphor-Imaging-Bildschirm für 5 Minuten auf einen Bildradierer.
9. Entfernen Sie nach dem dritten Waschen die Membran aus der Hybridisierungsflasche, entfernen Sie den überschüssigen Puffer auf der Membran mit Papiertüchern und legen Sie die Membran in einen durchsichtigen Plastikpapierhalter. Kontrollieren Sie radioaktive Signale auf der Membran mit einem Geigerzähler. Setzen Sie den Bildschirm für die gelöschte Phosphor-Bildgebung je nach Signalintensität 10 Minuten bis über Nacht der Membran aus.
10. Scannen Sie den Bildschirm mit einem Phosphorbild-Scansystem und erhalten Sie die Daten über die Signalintensität jedes Punktes.

Tabelle 1: Quantitative Dot-Blot-Plasmid-DNA-Standards. Erforderliche Volumina von 25 pg/μL Plasmid-DNA-Standardlösung und Wasser oder TE zur Herstellung von Plasmid-DNA-Standards durch zweifache serielle Verdünnungen (600 μl/Röhrchen) sind dargestellt. Die Zahlen in der Plasmid-DNA-Standardspalte (0,039 bis 5 ng) sind die DNA-Menge in 200 μl jeder Plasmid-DNA-Standardlösung.