1. Probenvorbereitung
- Nehmen Sie 50 mg Mausgewebe in ein 1,5-ml-Röhrchen. Fügen Sie 200 μl Lysepuffer (50 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1 % Triton X-100, 10 % Glycerin) hinzu, ergänzt mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (100 mM NaF, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 5 μg/mL Pepstatin, 10 μg/mL Leupeptin, 5 μg/ml Aprotinin).
- Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Homogenisator für 1 min auf Eis.
- 10 min bei 8.000 x g bei 4 °C zentrifugieren.
- Den Überstand in neue Röhrchen (1,5 ml) füllen und 1 μl für den Proteinkonzentrationsassay mit einem BCA-Kit entnehmen.
HINWEIS: Alle gebräuchlich verwendeten Lysepuffer für die Western-Blot-Analyse und die Dot-Blot-Analyse können für die QDB-Analyse verwendet werden.
2. Bestimmung der Spezifität von Antikörpern
- Probenlysate (20 μg) in Abschnitt 1.4, IgG-freies BSA (20 μg) und Standardprotein (600 pg) für die Western-Blot-Analyse vorbereiten.
HINWEIS: Als Negativkontrolle wird IgG-freies BSA und als Positivkontrolle das Standardprotein verwendet. Die Spezifität des Antikörpers wird durch die Darstellung einer Bande der richtigen Größe mit Hilfe der Western-Blot-Analyse nachgewiesen.
3. Definieren des linearen Bereichs der QDB-Analyse
- Das Standardprotein wird mit ddH2O aufgelöst. Verdünnen Sie das Protein auf eine Konzentration von 1.200 pg/μl.
- Das konzentrierte Protein aus den vorbereiteten Proben in Abschnitt 1.4 auf 4 μg/μl wird verdünnt.
- Löse das BSA mit ddH2O auf. Verdünne das Protein auf eine Konzentration von 1.200 pg/μl und 4 μg/μl.
- Eine Reihe von Verdünnungen von Standardprotein und vorbereiteten Proben wurden unter Berücksichtigung von Tabelle 1 und Tabelle 2 hergestellt.
- Mischen Sie 10 μl Verdünnungsstandardprotein oder verdünnungsvorbereitete Proben und 10 μl 2x Ladepuffer (120 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 % Glycerin, 4 % SDS, 0,2 % Bromphenolblau, 200 mM DTT) miteinander.
- Die Mischungen bei 85 °C 5 Min. erhitzen.
4. Ablauf der QDB-Analyse
- Anwendungsbeispiel
- Stützen Sie die QDB-Platte ab, um zu vermeiden, dass die Unterseite der Platte die Oberfläche des Tisches berührt. Verwenden Sie zum Beispiel eine leere Pipettenspitzenbox als Stütze.
- Laden Sie bis zu 2 μl der Probe in die Mitte der Membran am Boden der einzelnen Einheit der QDB-Platte.
- Trocknen der Platte
- Lassen Sie die geladene QDB-Platte 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) oder lassen Sie die geladene Platte 15 Minuten lang bei 37 °C in einem gut belüfteten Raum.
- Blockieren der Platte
- Tauchen Sie die QDB-Platte in den Transferpuffer (0,039 M Glycin, 0,048 M Tris, 0,37 % SDS, 20 % Methylalkohol) und schütteln Sie die Platte vorsichtig für 10 s.
- Spülen Sie die QDB-Platte dreimal vorsichtig mit TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung, 0,1 % Tween 20) und waschen Sie die Platte dann 5 Minuten lang in TBST unter ständigem Schütteln.
- Blockieren Sie die QDB-Platte mit Blockierungspuffer (5 % fettfreie Milch in TBST (100 μl/Well) für 1 h unter ständigem Schütteln.
- Inkubation von Primärantikörpern
- Verdünnen Sie den Primärantikörper im Blockierungspuffer in einer gewählten Konzentration (von 1: 500 bis 1: 5.000) und geben Sie 100 μl in jede einzelne Vertiefung einer gewöhnlichen 96-Well-Platte. Setzen Sie die QDB-Platte in die 96-Well-Platte ein und inkubieren Sie die kombinierten Platten entweder 2 Stunden lang bei RT oder über Nacht bei 4 °C unter ständigem Schütteln.
- Alternativ können Sie die QDB-Platte in eine Schachtel legen und die Schachtel 2 bis 3 mm über dem Membranteil der Platte mit einem Blockierungspuffer füllen, wenn derselbe Antikörper für die gesamte Platte verwendet wird. Geben Sie den Primärantikörper in der gewählten Konzentration hinzu und inkubieren Sie die Platte entweder 2 Stunden lang bei RT oder über Nacht bei 4 °C unter ständigem Schütteln.
- Spülen Sie die Platte dreimal vorsichtig mit TBST aus, bevor Sie sie dreimal mit TBST waschen, jedes Mal 5 Minuten lang unter ständigem Schütteln.
- Inkubation von sekundären Antikörpern
- Verdünnen Sie den Sekundärantikörper im Blockierungspuffer bei der gewählten Konzentration (von 1:1.000 bis 1:50.000) und aliquotieren Sie entweder 100 μl/Well in eine 96-Well-Platte oder in eine Box, wie in Abschnitt 4.4.2 beschrieben, und inkubieren Sie dann die QDB-Platte entweder in der geladenen 96-Well-Platte oder in der Box für 1 h bei RT unter ständigem Schütteln.
- Spülen Sie die QDB-Platte 3 Mal vorsichtig mit TBST aus und waschen Sie die Platte dann 3 Mal à 5 min mit TBST unter ständigem Schütteln.
- Quantifizierung
- Bereiten Sie ein erweitertes Chemilumineszenzsubstrat (ECL) vor, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
- Aliquotieren Sie das ECL-Substrat in eine 96-Well-Platte (100 μl/Well) und setzen Sie die QDB-Platte 2 Minuten lang unter ständigem Schütteln in die 96-Well-Platte ein.
- Nehmen Sie die QDB-Platte von der 96-Well-Platte und schütteln Sie sie kurz, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Legen Sie die Platte auf eine weiße Mikrotiterplatte.
- Schalten Sie den Mikroplatten-Reader ein und wählen Sie auf der Benutzeroberfläche "Platte mit Abdeckung", bevor Sie die kombinierten Platten (QDB-Platte + weißer Plattenadapter) zur Quantifizierung in den Mikroplatten-Reader legen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die weiße, undurchsichtige Mikrotiterplatte als Adapter verwenden, um Störungen durch die Platte zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass Sie "Platte mit Abdeckung" wählen, um ein Verklemmen des Geräts zu vermeiden, wenn kombinierte Platten (QDB-Platte + 96-Well-Plattenadapter) in den Mikroplatten-Reader eingelegt werden.
Tabelle 1. Verdünnungsschema für die Standardproteinkurve.
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| S1
(0 pg/μl) | S2 (33,3 pg/μl) | S3
(100 pg/μl) | S3
(300 pg/μl) | S5
(600 pg/μl) | S6
(1200 pg/μl) |
| Standardprotein (1200 pg/μl) | 0 | 1,39 | 4,17 | 12,5 | 25 | Nr. 50 |
IgG-freies BSA
(4 pg/μl) | Nr. 50 | 48,61 | 45,83 | 37,5 | 25 | 0 |
| gesamt | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 |
Tabelle 2. Verdünnungsschema für vorbereitete Proben
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| X1
(0μg/μl) | X2
(0,25 μg/μl) | X3
(0,5 μg/μl) | X4
(1μg/μl) | X5
(2μg/μl) | X6
(4 μg/μl) |
| Probe (4μg/μl) | 0 | 3.125 | 6,25 | 12,5 | 25 | Nr. 50 |
| IgG-freies BSA (4μg/μl) | Nr. 50 | 46.875 | 43,75 | 37,5 | 25 | 0 |
| gesamt | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 | Nr. 50 |
