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HINWEIS: Dieses Protokoll wurde unter Verwendung standardisierter, kommerziell erhältlicher Kits und Reagenzien optimiert, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen (siehe Materialtabelle).
1. Vorbereitung der Proben
- Protein-Extraktion
- Tiefgefrorene Zell- oder Gewebeproben ab -80 °C auf Trockeneis übertragen, auf Eis auftauen und bei Bedarf mit eiskalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. Vermeiden Sie unnötige Gefrier-Auftau-Zyklen, da dies die Proteinqualität beeinträchtigt.
- Geben Sie zu jeder Probe einen Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA)-Puffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 1 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS), der 1x Proteaseinhibitor enthält, wobei die optimale Menge pro Gewebegewicht verwendet wird.
Anmerkung: Je nach Anwendung kann es sein, dass die Art und Menge des Homogenisierungspuffers weiter optimiert werden muss.
- Verwenden Sie einen tragbaren elektrischen Homogenisator mit einem Polypropylen-Stößel, um Gewebeproben zu homogenisieren. Waschen Sie den Stößel zwischen jeder Probe in doppelt destilliertem Wasser und trocknen Sie ihn mit einem sauberen Tuch ab. Wechseln Sie den Stößel zwischen verschiedenen Versuchsbedingungen und Geweben.
- Lassen Sie die Proben nach der Homogenisierung 10 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben bei >10.000 x g bei 4 °C für 10 min.
- Den Überstand in ein neues Röhrchen auf Eis umfüllen, ohne das Pellet zu stören. Der Überstand ist die Proteinprobe. Lagern Sie das extrahierte Protein bei -80 °C oder fahren Sie direkt mit der Messung der Proteinkonzentration fort.
- Quantifizierung und Normalisierung der Proteinkonzentration
- Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay. Bereiten Sie eine BCA-Assay-Mischung gemäß den Anweisungen des Herstellers in einer optischen 96-Well-Platte mit 200 μl BCA-Mischung pro Well vor.
Anmerkung: Andere Quantifizierungsmethoden wie Lowry- und Bradford-Assays können ebenfalls zur Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet werden, solange die Proteinkonzentration über alle Experimente hinweg konsistent quantifiziert wird.
- Bereiten Sie Rinderserumalbumin (BSA)-Standards in steigenden Konzentrationen in dreifacher Ausfertigung vor und fügen Sie 1 μl jeder Proteinprobe in zweifacher Ausfertigung hinzu. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte in einem vorgeheizten Heizblock bei 60 °C für 10 Minuten oder länger, wenn eine niedrige Proteinkonzentration zu erwarten ist.
- Nach der Inkubation ist die Absorption bei 560 nm mit einem Plattenleser zu messen.
- Exportieren Sie die Messungen des Plattenlesers und berechnen Sie die Proteinkonzentration, indem Sie die durchschnittlichen Absorptionswerte jeder Probe mit einer Standardkurve vergleichen, die mit dem Proteinstandard erhalten wurde. Der R-Quadrat-Wert für die Standardkurve sollte größer oder gleich 0,98 sein, um die Proteinkonzentration der Probe genau zu schätzen.
- Normalisieren Sie die Proteinmenge, indem Sie Verdünnungen von Proteinproben in Probenpuffer und Reinstwasser vorbereiten. Das Gesamtvolumen kann je nach Art des verwendeten Gels angepasst werden. Es wird empfohlen, 30 μg Protein pro Bahn als Ausgangsmenge zu laden. Je nach Bedarf ist ein Reduktionsmittel wie Dithiothreitol (DTT; Endkonzentration 5 mM) oder Beta-Mercaptoethanol (Endkonzentration 200 mM) zu jeder Probe hinzuzufügen. Unverdünntes Beta-Mercaptoethanol in einem Abzug pipettieren.
- Inkubieren Sie die Proben in einem Heizblock bei 70 °C für 10 min. Legen Sie die Proben auf Eis, wirbeln Sie sie und drehen Sie sie zum Sammeln kurz nach unten. Auf Eis halten, bis das Gel geladen ist.
2. Gelelektrophorese von Proteinproben
- Geräte- und Gel-Setup
- Richten Sie ein vorgefertigtes 4–12%iges Bis-Tris-Gradientengel (siehe Materialtabelle) im Gelelektrophorese-Kammersystem ein. Spülen Sie die Gele vor Gebrauch mit doppelt destilliertem Wasser ab.
HINWEIS: Abhängig von der Größe, den Wechselwirkungen und der Häufigkeit des interessierenden Proteins können Gele mit einem anderen Gradienten, Puffermittel oder einer anderen Well-Größe und -Anzahl verwendet werden.
- Geben Sie 500 mL 1x MES SDS-Laufpuffer in doppelt destilliertem Wasser pro Tank hinzu. Entfernen Sie den Kamm vorsichtig von den Gelen, nachdem Sie den Laufpuffer hinzugefügt haben, ohne die Vertiefungen im Stapelgel zu stören.
- Protein-Beladung
- Laden Sie 3,5 μl eines Proteinstandards in die Vertiefung. Je nach Probenlayout kann das Laden einer Proteinleiter auf beiden Seiten des Gels zu einer genaueren Abschätzung der Proteingröße beitragen. Verwenden Sie Gelladespitzen mit feiner Spitze für eine genauere Probenbeladung.
- Wenn Sie einen internen Standard für die Normalisierung zwischen den Membranen verwenden (siehe Schritt 5 unten und Diskussion), laden Sie eine Menge, die den anderen Proben entspricht, in die ersten 3 Vertiefungen neben der Proteinleiter.
- Laden Sie 30 μg jeder Probe in die verbleibenden Wells. Geben Sie 1x Probenpuffer in alle leeren Vertiefungen.
- Elektrophorese
- Bauen Sie den Geltank zusammen, nachdem Sie die Proben geladen haben. Lassen Sie die Proben 10 Minuten lang bei 80 V und anschließend weitere 45-60 Minuten bei 150 V durch das Stapelgel laufen.
3. Proteintransfer
HINWEIS: Der Proteintransfer in diesem Protokoll wird mit einem kommerziell erhältlichen Semi-Dry-Blotting-System (siehe Materialtabelle) durchgeführt, um schnelle und konsistente Ergebnisse zu erzielen.
- Bereiten Sie den Proteintransfer vor, indem Sie das Filterpapier in doppelt destilliertem Wasser einweichen und sicherstellen, dass das Gelmesser, die Pasteur-Plastikpipette, die Löschwalze und die Pinzette einsatzbereit sind.
- Öffnen Sie den Transferstapel, indem Sie vorsichtig alle Verpackungsfolien entfernen. Nehmen Sie den oberen vom unteren Stapel und legen Sie ihn beiseite. Befeuchten Sie die Membran auf dem unteren Stapel schnell mit mehreren Tropfen Elektrophorese-Laufpuffer (2-3 mL). Sobald der Transferstapel geöffnet ist, ist es wichtig, ein Austrocknen der PVDF-Membran zu verhindern.
- Nachdem Sie die Elektrophorese gestoppt haben, öffnen Sie das vorgegossene Gel mit dem Gelmesser und schneiden Sie das Stapelgel ab. Schneide das Gel an den Rändern ab, um es vom Plastikguss zu befreien. Halten Sie das Gelmesser nass, um eine Beschädigung des Gels zu vermeiden.
- Montieren Sie den Transferstapel von unten nach oben: unterer Stapel (mit der PVDF-Membran), Proteingel und Filterpapier. Verwenden Sie die Löschwalze, um alle Luftblasen zu entfernen. Legen Sie den oberen Stapel auf das Filterpapier und rollen Sie den Stapel erneut, um Luftblasen zu entfernen. Drücken Sie nicht zu stark, da dies dazu führen kann, dass sich das Gel während des Proteintransfers verformt.
- Übertragen Sie den gesamten Stapel mit der Elektrode auf der linken Seite des Geräts in die Transfervorrichtung und legen Sie den Gelschwamm so auf den Stapel, dass er mit den entsprechenden elektrischen Kontakten am Gerät ausgerichtet ist. Schließen Sie den Deckel, wählen Sie das entsprechende Programm aus und starten Sie es (20 V für 7 min ist ein empfohlener Startpunkt).
- Wenn Sie fertig sind, lassen Sie den Deckel 2 Minuten geschlossen, damit der Stapel abkühlen kann und die Membran nicht austrocknet. Entfernen Sie den Transferstapel und schneiden Sie die Membran auf die Gelgröße zu. Waschen Sie die geschnittene Membran schnell mit doppelt destilliertem Wasser, bevor Sie mit dem Gesamtproteinfleck fortfahren.
4. Färbung des Gesamtproteins
HINWEIS: Die Verwendung von Fluoreszenzdetektion bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber traditionelleren Ansätzen (z.B. ECL-Detektion), da der lineare Bereich und die Empfindlichkeit viel besser gesteuert werden können. Daher werden in den Schritten 4 und 5 fluoreszierende TPS und fluoreszierende Sekundärantikörper verwendet (siehe Materialtabelle).
- Rollen Sie die Membran mit der Proteinseite nach innen in ein 50-ml-Röhrchen. Aufgrund der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden TPS und der Sekundärantikörper werden alle nachfolgenden Schritte im Dunkeln durchgeführt.
- Geben Sie 5 ml Proteinfärbelösung hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Walze. Da TPS und Waschpuffer Methanol enthalten, sollten Sie diese Schritte in einem Abzug durchführen.
- Entsorgen Sie die Färbelösung und waschen Sie sie zweimal schnell mit den 5 ml Waschlösung (6,3 % Essigsäure in 30 % Methanol). Legen Sie den Schlauch zwischen den Waschschritten kurz wieder auf die Walze. Spülen Sie die Membran kurz mit Reinstwasser ab, bevor Sie fortfahren.
5. Blockierung, Antikörperinkubation und Nachweis
- Blockieren der Membran: Geben Sie 3 ml Blockierungspuffer (siehe Materialtabelle) in das 50-ml-Röhrchen, das die Membran enthält. Inkubieren Sie die Membran auf einer Walze 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Abhängig von der Wahl des Antikörpers kann die Art des verwendeten Blockierungspuffers optimiert werden.
- Inkubation von Primärantikörpern
- Der Blockierungspuffer wird verworfen und durch den Primärantikörper in der geeigneten, optimierten Konzentration ersetzt (Abbildung 1 und Abbildung 2: Maus-Anti-SMN, im Verhältnis 1:1.000, verdünnt in Blockierungspuffer).
Anmerkung: Eine adäquate Optimierung von Primärantikörpern sollte die Bestätigung beinhalten, dass der Antikörper ein Proteinprodukt der richtigen Größe nachweist, während er keine oder nur eine minimale Bindung an andere, unspezifische Proteinprodukte zeigt. Wenn möglich, testen und vergleichen Sie mehrere Antikörper gegen das gewünschte Protein.
- Die Membran wird über Nacht auf einer Walze bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag die Antikörperlösung entfernen und 6 mal für 5 min mit 1x PBS auf einer Rolle bei Raumtemperatur (RT) waschen.
- Inkubation von sekundären Antikörpern
- Bereiten Sie den spezifischen Sekundärantikörper im Verhältnis 1:5.000 gegen den Wirt des Primärantikörpers in einem 5-ml-Blockierungspuffer vor. Andere Sekundärantikörper können andere Verdünnungen oder die Verwendung alternativer Blockierungspuffer erfordern.
- Inkubieren Sie die Membran mit der Sekundärantikörperlösung auf einer Walze für 1 h bei RT. Nach der Inkubation die Membran dreimal 30 min mit 1x PBS auf einer Rolle waschen.
- Trocknen Sie die Membran und schützen Sie die Membran bis zur Entdeckung mit Aluminiumfolie vor Licht. Die Membranen können für eine Langzeitlagerung bei 4 °C aufbewahrt werden.
- Bilderfassung
- Melden Sie sich an dem Computer an, der an den Scanner angeschlossen ist. Legen Sie die Membran mit der Proteinseite nach unten auf den Scanner und wählen Sie den Scanbereich in der Software aus.
- Optimieren Sie die Laserintensität für beide Kanäle (700 nm und 800 nm), indem Sie sicherstellen, dass keine Sättigung auftritt. Erfassen Sie die Bilder in beiden Kanälen und exportieren Sie die Bilder zur weiteren Analyse (Schritt 6).
6. Western-Blot-Analyse und -Quantifizierung
HINWEIS: Diese Empfehlungen basieren auf der frei verfügbaren Image Studio-Software. Vergleichbare Analysen können aber auch mit anderen Softwarepaketen, wie z.B. ImageJ, durchgeführt werden.
- Importieren Sie die Datei: Erstellen Sie einen lokalen Arbeitsbereich auf dem Computer, der für die Analyse verwendet wird. Dadurch wird eine Datenbank mit Bilddateien für erfasste Western-Blots generiert. Importieren Sie die auf dem Scanner erhaltenen Dateien und wählen Sie das Bild für die Analyse aus.
- TPS-Analyse
- Zeigen Sie den 700-nm-Kanal an, um das Gesamtergebnis der Proteinfärbung anzuzeigen. Ein Beispiel für ein TPS-Bild ist in Abbildung 1 enthalten, in dem verschiedene Gewebe von neonatalen (P5) (Abbildung 1A-B) und 10 Wochen alten Mäusen (Abbildung 1C-D) direkt verglichen werden. In ähnlicher Weise zeigt Abbildung 2 ein Beispiel für einen direkten Vergleich von Hirngewebe von Mäusen unterschiedlichen Alters
.
- Wählen Sie in der oberen rechten Ecke die Registerkarte Analyse aus, und wählen Sie Rechteck hinzufügen aus, um den Interessenbereich für die Normalisierung zu definieren (Abbildung 1B, D). Kopieren Sie den ersten Rechteckbereich und fügen Sie ihn in jede einzelne Probe ein, um sicherzustellen, dass der definierte Bereich für alle analysierten Spuren die gleiche Größe hat.
- Kopieren Sie das Ergebnis von der Registerkarte Formen in der unteren linken Ecke der Software.
- Quantifizierung
Anmerkung: Der optimale Ansatz zur Quantifizierung von Proben hängt vom Versuchsdesign ab. Wir werden hier ein illustratives Beispiel für den Nachweis des Überlebens-Motoneuronenproteins (Smn; ein Schlüsselprotein, das an der neuromuskulären Erkrankung spinale Muskelatrophie beteiligt ist) geben, von dem bekannt ist, dass es im Laufe der Zeit abnimmt, und wie die Normalisierung der Smn-Signalintensität auf TPS zuverlässige Schätzungen der Proteinexpressionsentwicklung liefert.
- Abbildung 2 zeigt eine Abnahme der Smn-Expression mit zunehmendem Alter des Tieres mit TPS als Proteinbelastungskontrolle. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.1 bis 6.2.3, um die Proteinbeladung zu quantifizieren (Abbildung 2B). Wiederholen Sie die Schritte 6.2.1 bis 6.2.3 im 800-nm-Kanal (Abbildung 2A), um das gewünschte Protein zu analysieren.
- Kopieren Sie die Ergebnisse sowohl von TPS als auch von Protein of Interest in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Normalisieren Sie in der Tabelle zunächst die Proteinbeladung, indem Sie das höchste TPS-Signal bestimmen und jeden TPS-Signalwert durch diesen Wert dividieren, um den normalisierten Proteinbeladungswert zu erhalten.
- Teilen Sie den 800-nm-Signalwert jeder einzelnen Probe durch den entsprechenden normalisierten Proteinwert, um das relative Proteinexpressionsverhältnis in verschiedenen Proben zu berechnen.
- Vergleichen Sie nach der ersten Normalisierung verschiedene Zeitpunkte oder Gewebe mit dem Durchschnittswert des internen Standards, um direkte Vergleiche über verschiedene Membranen und Experimente hinweg zu ermöglichen.
