1. Bestimmung der Zellzusammensetzung in der Zellsuspension mittels Einzelzell-Western-Blot-Analyse (scWB)
- Rehydrieren Sie den scWB-Chip vor der Verwendung in 15 mL 1x Suspensionspuffer in einer Petrischale für mindestens 10 Minuten bei RT.
- Geben Sie 1 ml der verdünnten einzelligen Suspension (10.000-100.000 Zellen/ml) in den rehydrierten Chip. Legen Sie die Oberfläche auf den Boden einer 10 cm großen Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche flach eingestellt ist.
- Decken Sie die Petrischale mit einem Deckel ab, um ein Austrocknen zu verhindern, und lassen Sie die Zellen 5-15 Minuten lang durch einen Gradienten absetzen.
- Legen Sie den Chip unter ein Hellfeldmikroskop und inspizieren Sie die Vertiefungen bei 10-facher Vergrößerung.
Anmerkung: Ungefähr 15-20 % der Mikrovertiefungen sollten von einer einzelnen Zelle belegt werden, und weniger als 2 % der Vertiefungen sollten 2 oder mehr Zellen enthalten.
- Kippen Sie die 10 cm große Petrischale, in der sich der Chip befindet, um 45 Grad.
- Waschen Sie den Chip mit dem 1x Suspensionspuffer, um nicht eingefangene Zellen von der Oberfläche des Chips zu entfernen, indem Sie vorsichtig von der Ober- zur Unterseite des Chips pipettieren. 3 Mal wiederholen.
- Bereiten Sie das einzellige Westerninstrument vor.
- Stellen Sie die Lysezeit, die Elektrophoresezeit und die UV-Erfassungszeit ein. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen, um rekrutierte Makrophagen zu analysieren, die aus dem von der Basalmembran abgeleiteten Gelpfropfen gewonnen wurden: Lysezeit: 0 s; Elektrophoresezeit: 160 s; UV-Einfangzeit 240 s.
- Laden Sie den Chip vorsichtig in die Elektrophoresezelle des einzelligen westlichen Instruments, mit der Gelseite. Seien Sie vorsichtig, um die Gelseite des Chips nicht zu beschädigen.
- Gießen Sie den Lyse-/Laufpuffer in die Kammer und bedecken Sie den gesamten einzelligen Western-Chip vollständig. Starten Sie die Zelllyse.
- Führen Sie das scWB-Instrument mit der in 1.8 aufgeführten Einstellung aus.
- Sobald der Lauf abgeschlossen ist, geben Sie den Chip in eine 10 cm Petrischale und waschen Sie den Chip zweimal mit 1x Waschpuffer für 10 min bei RT.
- Verdünnungen des Primärantikörpers (Anti-Vinculin: 1:10; Anti-CD45: 1:15, Anti-CD11b: 1:20, Anti-F4/80: 1:10) in einem Gesamtvolumen von 80 μl Antikörperverdünnungsmittel vorbereiten (Mischung aus 8 μl Antikörper 1 plus 8 μl Antikörper 2 plus 64 μl Verdünnungsmittel).
- Geben Sie 80 μl der primären Antikörperlösung in die Antikörper-Sondierungskammer und senken Sie die Gelseite des Chips ab, so dass die Antikörperlösung über den Chip geleitet wird.
- Inkubieren Sie mit der primären Antikörperlösung für 2 h bei RT.
- Waschen Sie den Chip dreimal für 10 min in 1x Waschpuffer auf dem Shaker.
- Waschen Sie den Chip einmal für 10 min im Wasser auf dem Shaker, um das Gel zu entsalzen.
- Bereiten Sie eine Verdünnung des Sekundärantikörpers im Verhältnis 1:20 in einem Gesamtvolumen von 80 μl vor (mischen Sie 2 μl Sekundärantikörper plus 78 μl Verdünnungsmittel).
- Inkubieren Sie den Chip mit einem Sekundärantikörper für 1 h bei RT lichtgeschützt.
- Waschen Sie den Chip dreimal für 10 min mit 1x Waschpuffer auf dem Shaker.
- Drehen Sie den Chip mit einem Schieberegler, um den verbleibenden Waschpuffer zu entfernen.
- Scannen Sie den Chip auf einem Dual-Laser-Microarray-Scanner mit einer Auflösung von 5 μm am Spektralkanal des Fluorophors, das an die Sekundärantikörper gekoppelt ist.
- Analysieren Sie Daten mit scWB-spezifischer Software.
2. Entfernen des scWB-Chips
- Bewahren Sie den gescannten Chip in einem Waschpuffer auf, bis er abgezogen werden kann.
- Stellen Sie das Wasserbad in einen Abzug.
- Stellen Sie ein 50-ml-Röhrchengestell in das Wasserbad, wobei das Wasser nur 1 cm über dem Gestell steht, und stellen Sie die Wassertemperatur auf 60 °C ein.
- Bereiten Sie den Abstreifpuffer vor. Für 1 l Stripping-Pufferlösung werden 9,85 g Tris-HCl (pH 6,8) und 20 g SDS in 900 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert eingestellt. Dann mit destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. Unmittelbar vor jedem Gebrauch 0,8 % (v/v) β-Mercaptoethanol (β-ME; 14,3 M) hinzufügen.
- Legen Sie den Chip nach dem ersten Scan in eine 10 cm große Petrischale, bevor Sie ihn abstreifen.
- Nehmen Sie für jeden Chip 40 mL Stripping-Puffer und fügen Sie 320 μl β-ME hinzu.
ACHTUNG: β-ME ist giftig und gefährlich für Mensch und Umwelt. Das folgende Verfahren sollte in einem Abzug durchgeführt werden.
- Legen Sie den Chip in den Kanister und versiegeln Sie den Kanister mit Parafilm, um zu verhindern, dass Wasser in den Kanister eindringt
- Legen Sie den Kanister in das Röhrchengestell in das vorgewärmte Wasserbad.
- 90 min inkubieren.
- Nehmen Sie den Chip vorsichtig aus dem Kanister und legen Sie ihn in eine frische Petrischale.
- Waschen Sie den Chip einmal kurz mit 1x Waschpuffer. Geben Sie dann 15 mL 1x Waschpuffer in die Petrischale.
- Den Chip 15 min auf einem Shaker waschen. Wiederholen Sie den Waschschritt viermal.
Anmerkung: Der Chip ist bereit für den nächsten Primärantikörper (siehe Schritte 1.12 - 1.21)
