Chemilumineszenz-Western-Blot-Assay für die Proteinverarbeitung

Zusammenfassung

Quelle: Hillert-Richter, L. K. et al., Messung der Zusammensetzung des CD95-todinduzierenden Signalkomplexes und der Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video beschreibt das Chemilumineszenz-basierte Western Blot von immunpräzipitierten Lysaten. Die Technik hilft bei der Bestimmung der Proteinverarbeitung und -aktivierung. Das detektierte Chemilumineszenzsignal ist proportional zum Grad der Proteinverarbeitung während seiner Aktivierung.

Protokoll

T-Zell-Experimente wurden gemäß der ethischen Vereinbarung 42502-2-1273 Uni MD durchgeführt.

1. Zellen für das Experiment vorbereiten

HINWEIS: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen für diese Immunpräzipitation beträgt 1 × 10⁷. Adhärente Zellen müssen einen Tag vor dem Experiment ausgesät werden, so dass am Tag des Experiments 1 ×^{10 7} Zellen vorhanden sind.

1. Vorbereitung der adhärenten Zellen für das Experiment
   1. Säen Sie 5-8 × 10⁶ adhärente Zellen in 20 ml Medium (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) für jede Bedingung in 14,5 cm Schalen einen Tag vor Beginn des Versuchs.
   2. Stellen Sie am Tag des Experiments sicher, dass die Zellen zu 80-90 % zusammenfließen und an der Schale haften. Entsorgen Sie das Medium und geben Sie frisches Medium zu den anhaftenden Zellen.
2. Vorbereitung der Suspensionszellen für das Experiment
   1. Unmittelbar vor Beginn des Experiments werden 1 × 10 7 Suspensionszellen vorsichtig in 10 ml Kulturmedium (Zusammensetzung siehe Materialtabelle) in 14,5-cm-Schalen gegeben.
   2. Bei Verwendung von Primärzellen sind die primären T-Zellen nach dem zuvor beschriebenen Verfahren zu isolieren. Primäre T-Zellen werden 24 Stunden lang mit 1 μg/ml Phytohämagglutinin behandelt, gefolgt von einer IL2-Behandlung mit 25 μg/ml für 6 Tage.
   3. Unmittelbar vor Beginn des Versuchs werden 1 × 10 8 primäre T-Zellen vorsichtig in 10 ml Kulturmedium (Zusammensetzung siehe Materialtabelle siehe Materialtabelle) in 14,5 cm Schalen gelegt.
      Anmerkung: Diese höhere Anzahl an primären T-Zellen wird empfohlen, da diese Zellen kleiner sind.

2. CD95L-Stimulation

1. Stimulieren Sie die Zellen mit CD95L (hergestellt wie zuvor beschrieben oder kommerziell erhältlich (siehe Materialtabelle).
   Anmerkung: Die Konzentration des CD95L und der Zeitpunkt der Stimulation sind zelltypabhängig. Bereiten Sie eine Stimulationsbedingung zweimal vor, um parallel eine "Bead-Control"-Probe zu erzeugen.
   1. Stimulieren Sie adhärente Zellen mit der gewählten Konzentration von CD95L. Halten Sie die Platte schräg und pipetieren Sie den Liganden in das Medium, ohne die anhaftenden Zellen zu berühren.
   2. Stimulieren Sie Suspensionszellen mit CD95L, indem Sie die Ligandenlösung in die Zellsuspension pipettieren.

3. Zellernte und -lyse

1. Stellen Sie die Zellschalen auf Eis.
   Anmerkung: Entsorgen Sie das Medium nicht. Sterbende Zellen schwimmen im Medium und sind wichtig für die Analyse.
2. Geben Sie 10 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Zellsuspension und kratzen Sie die anhaftenden Zellen von der Platte. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-ml-Röhrchen.
3. Waschen Sie die Zellschale zweimal mit 10 ml kaltem PBS und geben Sie die Waschlösung in dasselbe 50-ml-Röhrchen. Die Zellsuspension wird bei 500 × g 5 min lang bei 4 °C zentrifugiert.
4. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen.
5. Die Zellsuspension wird bei 500 × g für 5 min, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet mit 1 ml kaltem PBS wieder suspendiert.
6. Die Zellsuspension wird bei 500 × g für 5 min, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet mit 1 ml Lysepuffer (enthält 4 % Proteasehemmer-Cocktail) wieder suspendiert. Inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis.
7. Zentrifugieren Sie das Lysat bei maximaler Geschwindigkeit (~17.000 × g) für 15 min, 4 °C.
8. Übertragen Sie den Überstand (Lysat) in ein sauberes Röhrchen. Entsorgen Sie das Pellet. Nehmen Sie 50 μl des Lysats in ein anderes Röhrchen. Analysieren Sie die Proteinkonzentration mit Hilfe des Bradford-Assays und entnehmen Sie die Lysatmenge, die 25 μg Protein in einem Fläschchen entspricht. Geben Sie dem Fläschchen einen Ladepuffer hinzu (die Zusammensetzung finden Sie in der Materialtabelle). Bei -20 °C als Lysatkontrolle lagern.

4. Immunpräzipitation (IP)

1. Fügen Sie dem Lysat 2 μl Anti-APO-1-Antikörper und 10 μl Protein-A-Sepharosekügelchen (wie vom Hersteller empfohlen hergestellt) hinzu. Geben Sie nur 10 μl der Kügelchen in ein separates Röhrchen mit Lysat (stimulierte Probe), um eine "Kügelchenkontrolle" zu erzeugen
   Anmerkung: Verwenden Sie Pipettenspitzen mit breiten Öffnungen, indem Sie entweder die Spitzen abschneiden oder spezielle Spitzen für IP kaufen, während Sie mit den Protein-A-Sepharosekügelchen umgehen.
2. Die Mischung aus Lysat mit Antikörpern/Protein-A-Sepharosekügelchen unter sanftem Mischen über Nacht bei 4 °C inkubieren. Die Lysate mit Antikörpern/Protein-A-Sepharosekügelchen bei 500 × g für 4 min, 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen, 1 ml kaltes PBS zu den Kügelchen geben und diesen Schritt mindestens dreimal wiederholen.
3. Entsorgen Sie den Überstand. Aspirieren Sie die Kügelchen vorzugsweise mit einer 50 μL Hamilton-Spritze.

5. Westlicher Blot

1. Geben Sie 20 μL 4x Ladepuffer (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung) zu den Kügelchen und erhitzen Sie sie 10 min lang bei 95 °C. Erhitzen Sie die Lysatregler 5 min lang bei 95 °C.
2. Laden Sie die Lysate, IPs und einen Proteinstandard auf ein 12,5%iges Natriumdodecylsulfat (SDS)-Gel (siehe Materialtabelle für die Gelherstellung) und betreiben Sie es mit einer konstanten Spannung von 80 V.
3. Übertragen Sie die Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Nitrozellulosemembran.
   Anmerkung: Hier wurde die halbtrockene Technik, optimiert für die interessierenden Proteine, für den Transfer über 12 min (25 V; 2,5 A = konstant) verwendet. Weichen Sie die Nitrozellulosemembran und zwei Mini-Transferstapel einige Minuten lang in Elektrophoresepuffer ein (die Zusammensetzung finden Sie in der Materialtabelle, Zubereitung gemäß den Anweisungen des Herstellers), bevor Sie das Western Blotting durchführen.
4. Legen Sie die getupfte Membran in eine Schachtel und blockieren Sie sie 1 h lang in einer Blockierungslösung (0,1 % Tween-20 in PBS (PBST) + 5 % Milch). Inkubieren Sie die Membran mit der Blockierlösung unter leichtem Rühren.
5. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten.

6. Western Blot-Nachweis

1. Geben Sie den ersten Primärantikörper in der angegebenen Verdünnung (siehe Materialtabelle) in die Membran und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren.
2. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten.
3. Inkubieren Sie die Membran mit 20 ml Sekundärantikörper (verdünnt 1:10.000 in PBST + 5 % Milch) unter leichtem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten.
5. Verwerfen Sie PBST und fügen Sie der Membran etwa 1 ml Meerrettichperoxidase-Substrat hinzu.
6. Erkennen Sie das Chemilumineszenzsignal (siehe Materialtabelle).
   Anmerkung: Die Belichtungszeit und die Anzahl der aufgenommenen Bilder hängen von der Menge des Proteins in der Zelle und der Spezifität der verwendeten Antikörper ab. Sie muss für jeden Antikörper, der für den Nachweis verwendet wird, empirisch nachgewiesen werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12,5% SDS-Gel	selbstgemacht		Für zwei Trenngele: 3,28 mL destilliertes H2O 2,5 mL Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 mL Acrylamid 100 μL 10% SDS 100 μL 10% APS 7,5 μL TEMED für zwei Sammelgele: 3,1 mL destilliertes H2O 1,25 mL Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,5 mL Acrylamid 50 μL 10% SDS 25 μL 10% APS 7,5 μL TEMED
14,5 cm Zellschalen	Greiner	Artikel-Nr.: 639160
Acrylamid	Carl Roth	Nr. A124.1
Aerosolfilter-Pipettenspitzen mit hohem Rücksteller und breiter Öffnung	VWR	46620-664 (Nordamerika) oder 732-0559 (Europa)	Wird zum Pipettieren von Kügelchen in das Lysat verwendet
Wird zum Pipettieren von Kügelchen in das Lysat verwendet	Sigma Aldrich	Nr. A2103	Verdünnung: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	Werden in diesen Versuchen von Prof. P. Krammer zur Verfügung gestellt oder können bei ENZO erworben werden	ALX-805-038-C100	Wird nur zur Immunpräzipitation verwendet
Anti-Caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Verdünnung: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
Anti-Caspase-3 Ab	Zelluläre Signalübertragung	9662 S	Verdünnung: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
Anti-Caspase-8 Ab C15	Werden in diesen Versuchen von Prof. P. Krammer zur Verfügung gestellt oder können bei ENZO erworben werden	ALX-804-242-C100	Verdünnung: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
Anti-CD95 Ab	Santa Cruz	SC-715	Verdünnung: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	Werden in diesen Versuchen von Prof. P. Krammer zur Verfügung gestellt oder können bei ENZO erworben werden	ALX-804-961-0100	Verdünnung: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
Anti-FADD 1C4 Ab	Werden in diesen Versuchen von Prof. P. Krammer zur Verfügung gestellt oder können bei ENZO erworben werden	ADI-AAM-212-E	Verdünnung: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
Anti-PARP-Ab	Zelluläre Signalübertragung	9542	Verdünnung: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
Aps	Carl Roth	9592,3
β-Mercaptoethanol	Carl Roth	4227,2
Bradford-Lösung Protein Assay Farbstoff-Reagenz-Konzentrat 450ml	Bio Rad	Nr. 500-0006	Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers
CD95L	Werden in diesen Versuchen von Prof. P. Krammer zur Verfügung gestellt oder können bei ENZO erworben werden	ALX-522-020-C005
Chemilumineszenz-Detektor Chem Doc XRS+	Bio Rad
Vollständiger Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Hergestellt nach Herstellerangaben
DPBS (10x) ohne Ca, Mg	PAN Biotech	Tel. P04-53500	Verdünnung 1:10 mit H2O, Lagerung im Kühlschrank
Elektrophorese-Puffer	selbstgemacht		10x Elektrophoresepuffer: 60,6 g Tris 288 g Glycin 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 Verdünnung vor Gebrauch
Glycin	Carl Roth	3908,3
Anti-Maus für Ziegen IgG1 HRP	SouthernBiotech	Nr. 1070-05	Verdünnung 1:10.000 in PBST + 5% Milch
Anti-Maus für Ziegen IgG2b HRP	SouthernBiotech	Nr. 1090-05	Verdünnung 1:10.000 in PBST + 5% Milch
Anti-Kaninchen-IgG-HRP für Ziegen	SouthernBiotech	Nr. 4030-05	Verdünnung 1:10.000 in PBST + 5% Milch
Interleukin-2 Mensch (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	Zur Aktivierung von T-Zellen
Kcl	Carl Roth	6781,2
KH2PO4	Carl Roth	Nr. 3904.1
Ladepuffer 4x Laemmli Probenpuffer, 10 mL	Bio Rad	Tel.: 161-0747	Hergestellt nach Herstellerangaben
Luminata Forte Western HRP-Substrat	Millipore	WBLUFO500
Lyse-Puffer	selbstgemacht		13,3 mL Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M 27,5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium für adhärente Zellen DMEM F12 (1:1) mit stabilem Glutamin, 2.438 g/L	PAN Biotech	Tel. P04-41154	Zugabe von 10 % FCS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,0001 % Puromycin zum Medium
Medium für primäre T-Zellen	gibco von Life Technologie	21875034	Zugabe von 10 % FCS und 1 % Penicillin-Streptomycin zum Medium
Milchpulver	Carl Roth	Nr. T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	Nr. P030.3
NaCl	Carl Roth	3957,2
PBST	selbstgemacht		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56,8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 Copyright © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Seite 3 von 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O Verdünnung 1:20 vor Gebrauch
PBST + 5% Milch	selbstgemacht		50 g Milchpulver + 1 L PBST
Pha	Thermo Fisher Scientific	R30852801	Zur Aktivierung von T-Zellen
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	Tel.: 161-0373	Verwendung zwischen 3-5 μL
Protein A Sepharose CL-4B Kügelchen	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Affinitätsharzperlen, die nach Herstellerangaben hergestellt
Schaber	VWR	Tel.: 734-2602
Sds	Carl Roth	4360,2
Mixbecher	Heidolph
Natriumazid	Carl Roth	Nr. K305.1
TEMED	Carl Roth	2367,3
Trans Blot Turbo Mini-Transferstacks	Bio Rad	Tel.: 170-4270	Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers
TransBlot Turbo 5x Transferpuffer	Bio Rad	10026938	Hergestellt nach Herstellerangaben
TransBlot Turbo Mini-Membran aus Nictrozellulose	Bio Rad	Tel.: 170-4270	Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chemischer gelöster Stoff	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051,4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	Nr. A4974,1000

kg kg kg kg kg kg werden kg kg kg kg