Northern Blot zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer microRNA im Gesamt-RNA-Extrakt von Pflanzengewebe

Zusammenfassung

Quelle: Tirumalai, V., et al. RNA-Blot-Analyse zum Nachweis und zur Quantifizierung pflanzlicher MicroRNAs. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir den Northern Blot, eine Hybridisierungstechnik zum Nachweis und zur Quantifizierung von microRNAs (miRNAs) aus Gesamt-RNA, die aus Pflanzengewebe extrahiert wird.

Protokoll

1. Gel-Elektrophorese

1. Stoppen Sie den Vorlauf und waschen Sie die Vertiefungen, bevor Sie die Proben laden.
2. Erhitzen Sie die Proben 1 Minute lang auf 98 °C und laden Sie die Proben mit Kapillarspitzen heiß in die Vertiefung. Führen Sie die Spitze in den Boden der Vertiefung ein, so dass die Probe eine dünne Schicht in der Vertiefung einnimmt.
3. Vollständiges Laden aller Proben. Schließen Sie die Beladung des RNA-Dekadenmarkers ein.
4. Lassen Sie das Gel bei 80 V laufen, bis der Bromphenolblau-Farbstoff fast vollständig abgelaufen ist. Bromphenolblau liegt bei 10 bp in einem 15%igen denaturierenden Acrylamidgel vor.

2. Vorbereitung für das Elektro-Blotting

1. Schneiden Sie die N+Nylon-Membran auf die Abmessungen einer Glasplatte zu und beschriften Sie die Membran in der oberen rechten Ecke mit einem HB-Bleistift.
2. Legen Sie die Membran vorsichtig auf die Oberfläche von sterilem Wasser, wobei Sie mit der beschrifteten Seite zur Wasseroberfläche zeigen. Die Membran 15 Minuten vorweichen.
3. Schneiden Sie 4 Stücke Löschpapier I in die Maße eines Faserpads.
4. Bereiten Sie das Gel-Sandwich vor, indem Sie die graue Seite der Kassette in eine saubere Schale legen.
5. Befeuchten Sie das Faserpad vor und legen Sie es über die Kassette. Entfernen Sie Luftblasen.
6. Befeuchten Sie ein Stück Löschpapier in 1x TBE und legen Sie es über das Faserpad. Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie eine Plastikpipette über das Papier rollen. Legen Sie ein weiteres Stück vornasses Löschpapier auf und entfernen Sie Luftblasen.
7. Nehmen Sie das Gel vorsichtig aus der Laufkassette und legen Sie es so über das Sandwich-Setup, dass die erste geladene RNA-Probe nach rechts zeigt.
8. Tauchen Sie die vorgetränkte Membran vorsichtig in 1x FSME und legen Sie sie mit der beschrifteten Seite nach unten über das Gel. Ausrollen, um die Luftblasen zu entfernen.
9. Tauchen Sie ein Stück Löschpapier ein, legen Sie es über die Membran und entfernen Sie die Luftblasen. Tauchen Sie ein weiteres Stück Löschpapier ein, legen Sie es über das Sandwich und entfernen Sie die Luftblasen.
10. Vervollständigen Sie das Sandwich, indem Sie ein vornasses Faserpad über das Setup legen und die Kassette fest verschließen.
11. Legen Sie die Transblot-Kassette in das Modul und füllen Sie 1x FSME, pH 8,2, bis zur Blottingmarke.
12. Umsteigen bei 10 V, über Nacht bei 4 °C.
13. Legen Sie nach dem Transfer die feuchte Membran auf ein Papierblatt und vernetzen Sie die RNA sofort durch Bestrahlung mit 254 nm UV-Licht (120.000 μJoule/cm²) mit der Membran. Der vernetzte Blot kann für eine weitere Hybridisierung bei 4 °C gelagert werden.

3. Vorbereitung der radioaktiv markierten Sonde

1. Entwerfen Sie eine Sonde, die vollständig komplementär zu der kleinen RNA ist, die nachgewiesen werden soll.
2. Beschriften Sie die Sonde mit ƳP32ATP (von BRIT gewonnen) an ihrem 5'-Ende, indem Sie die Komponenten gemäß dem in Tabelle 1 angegebenen Rezept kombinieren.
3. Das obige Reaktionsgemisch wird bei 37 °C 30 min lang inkubiert.
4. Trennen Sie unmarkiertes ƳP32ATP von der Sonde mit einer Sephadex G-25-Säule gemäß dem Protokoll des Herstellers.

4.Hybridisierung des Blots

1. Legen Sie den vernetzten Blot mit der RNA-Seite nach oben in eine Hybridisierungsflasche.
2. Mischen Sie den hochempfindlichen Hybridisierungspuffer kräftig, fügen Sie 10 ml davon hinzu und inkubieren Sie den Blot in einem Hybridisierungsofen bei 35 °C mit Rotation.
3. Führen Sie eine 20-minütige Vorhybridisierung durch.
4. Nehmen Sie die Flasche aus dem Ofen und geben Sie die etikettierte Sonde vorsichtig in den Hybridisierungspuffer.
5. Hybridisieren Sie den Blot bei 35 °C und drehen Sie ihn 12 h lang.
6. Übertragen Sie die Hybridisierungslösung nach der Hybridisierung vorsichtig in ein 15-ml-Röhrchen. Diese Lösung kann bis zur Wiederverwendung bei 4 °C gelagert werden.
7. Führen Sie eine schnelle Reinigung des Blots für 2 Minuten durch, um überschüssige Hybridisierungslösung durch Zugabe von 2x SSC-Puffer plus 0,5 % SDS zu entfernen. Verwerfe die Lösung.
8. Inkubieren Sie den Blot mit 2x SSC-Puffer plus 0,5% SDS für 35 °C, mit Rotation für 30 min.
9. Waschen Sie den Blot erneut mit 0,5x SSC-Puffer plus 0,5% SDS für 35°C, mit Rotation für 30 min.
10. Legen Sie den Blot in eine Hybridisierungsabdeckung, entfernen Sie den überschüssigen Puffer und versiegeln Sie ihn.
11. Setzen Sie es über Nacht in einer Kassette einem strahlungsfreien Phosphor-Imager-Bildschirm aus.
12. Detektieren Sie das Hybridisierungssignal mit einem biomolekularen Imager und analysieren Sie die Ergebnisse mit geeigneter Software.

Tabelle 1: Tabelle der Rezepte

Puffer und Lösung	Rezept	Kommentare
10 X TBE	0,89 M Tris-Puffer	pH sollte mit Essigsäure auf 8,2 gesetzt werden
	0.89M Borsäure
	30 mM EDTA
Gelmischung	15% Acrylamid-Bisacrylamid Sol, 19:1	Gelmischung sollte keine Harnstoffkristalle enthalten
	8M Harnstoff
	1X TBE
Gel-ladender Farbstoff	0,05 %(w/v) Bromphenolblau	Vorsicht ist geboten beim Umgang mit deionisiertem Formamid
	0,05 %(w/v) Xylol-Xyanol
	100 % deionisiertes Formamid
Beschriftung der Sonde	PNK-Puffer (10X, 2 μL)	Dieses Gemisch enthält radioaktive Moleküle, dieser Schritt muss von geschultem Personal in einem radioaktiven Labor durchgeführt werden
	PNK-Enzym (1 μl)
	Oligo (100 μM, 0,1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Puffer waschen - I	2X SSC
	0,5 % (w/v) Sicherheitsdatenblatt
Waschpuffer - II	0,5-facher SSC
	0,5 % (w/v) Sicherheitsdatenblatt
Stripping-Puffer - I	0,5-facher SSC
	0,1 % (w/v) Sicherheitsdatensatz
Stripping-Puffer - II	0,1-facher SSC
	0,1 % (w/v) Sicherheitsdatensatz

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
40% Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung	Sigma	Nr. A9926	chemisch
Ammoniumpersulfat (APS)	BioRad	Artikel-Nr.: 1610700	chemisch
Löschpapier	Whatman Löschpapier I	Nr. 1001-125	Probe
Bromphenolblau	Sigma	B5525-5G	chemisch
Tipps zur Kapillarbelastung	BioRad	2239915	Kunststoff-Ware
Deionisiertes Formamid	Ambion	AM9342	chemisch
Heizblock	Eppendorf	5350	Gerät
Hybond N+Nylon-Membran	Ge	RPN203B	Probe
Hybridisierungs-Flasche	Sigma	Z374792-1EA	Kunststoff-Ware
Hybridisierungs-Ofen	Thermo Scientific	1211V79	Gerät
N,N,N',N'- Tetramethylethylendiamin (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	chemisch
PhosphorImager	GE- Taifun-Scanner	29187194	Gerät
PhosphorImager Bildschirm und Kassette	GE Gesundheitswesen	GE28-9564-75	Gerät
Pipetten	Gilson, Modelle: P20 und P10	FA10002M, FA10003M	Kunststoff-Ware
Pipette aus Kunststoff	Falke	Artikel-Nr.: 357550	Kunststoff-Ware
Polyacrylamid-Gel-Apparatur	BioRad	Artikel-Nr.: 1658003EDU	Gerät
Sephadex G-25 Säule	GE Gesundheitswesen	27532501	Gerät
Speed Vac Konzentrator	Thermo Scientific	Tel.: 20-548-130	Gerät
Drehen Sie sich	Tarsons	Nr. 1010	Gerät
T4-Polynukleotidkinase (PNK)	Schnabel	M0201S	Probe
Transblot-Apparatur	BioRad	1703946	Gerät
ULTRAHyb-Hybridisierungs-Puffer	Ambion	AM8670	Probe
Harnstoff	Fischer Scientific	Artikel-Nr.: 15985	chemisch
UV-Vernetzer	UVP	CL-1000L	Gerät
Wirbel	Tarsons	Nr. 3020	Gerät
Wasserbad	NEOLAB	Nr. D-8810	Gerät
Xylol-Cyanol	Sigma	X4126-10G	Probe

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