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>1. Produktion von 15N, 13C-Tau (Abbildung 1)
- ATransform pET15b-Tau rekombinantes T7-Expressionsplasmid in BL21(DE3)-kompetente Escherichia coli Bakterienzellen.
HINWEIS: Die cDNA, die für die längste Tau-Isoform (441 Aminosäurereste) kodiert, wird zwischen NcoI- und XhoI-Restriktionsstellen im pET15b-Plasmid kloniert.
- Mischen Sie vorsichtig 50 μl kompetente BL21(DE3)-Zellen, die 1-5 x 107 Kolonien pro μg Plasmid-DNA bilden, mit 100 ng Plasmid-DNA in einem 1,5-ml-Kunststoffröhrchen.
Anmerkung: Durch die Codon-Nutzung optimierte Bakterienstämme für die eukaryotische cDNA-Expression sind für die Produktion von humanem Tau nicht essentiell.
- Legen Sie die Zellmischung 30 Minuten lang auf Eis und dann 10 Sekunden lang einen Hitzeschock bei 42 °C. Stellen Sie das Röhrchen wieder für 5 Minuten auf das Eis und fügen Sie 1 ml LB (Luria-Bertani) Medium bei Raumtemperatur hinzu. Die Bakteriensuspension bei 37 °C 30 min unter leichtem Rühren inkubieren.
- 100 μl Zellsuspension mit einer Impfschlaufe gleichmäßig auf eine Agarplatte mit LB-Medium verteilen, die 100 μg/ml Ampicillin-Antibiotikum enthält.
- Inkubieren Sie die Auswahlplatte 15 Stunden lang bei 37 °C.
- Die Auswahlplatte wird bis zum Beginn des Kulturschritts bei 4 °C gehalten, d. h. maximal 2 Wochen lang.
HINWEIS: Ein Glycerinbestand aus Bakterienkultur (50 % Glycerin), der bei -80 °C gelagert wird, kann vorbereitet werden, um die Kultur zu einem späteren Zeitpunkt zu starten.
- 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100x MEM-Vitaminpräparat, 1 ml 100 mg/ml Ampicillin zu 1 l autoklavierten M9-Salzen (6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl) geben.
Anmerkung: Bei Zugabe der CaCl2-Lösung zu den M9-Salzen bildet sich ein weißer Niederschlag, der sich schnell auflöst.
- Solubilisieren Sie 300 mg 15N, 13C-vollständiges Medium, 1 g 15NH4Cl und 2 g 13C6-glucose in 10 ml M9-Medium. Die Isotopenlösung wird mit einem 0,2-μm-Filter direkt in das M9-Medium filtriert.
- Eine Kolonie von pET15b-Tau-transformierten Bakterien aus der Selektionsplatte wird mit einer Impfschlaufe in 20 ml LB-Medium, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin, suspendiert.
- Das beimpfte Medium wird bei 37 °C ca. 6 Std. inkubiert.
- Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) an 1 ml einer zehnfachen Verdünnung der Bakterienkultur in einer Kunststoffspektrometerküvette.
Anmerkung: Die Trübung der Bakterienkultur, die OD600 von 3,0-4,0 entspricht, zeigt an, dass die Sättigungswachstumsphase erreicht ist.
- 20 ml der gesättigten LB-Kultur werden in 1 l M9-Wachstumsmedium, das mit Ampicillin (100 μg/ml Endkonzentration) versetzt wird, in einen 2-l-Erlenmeyer-Kulturkolben aus Kunststoff gegeben.
- Der Kulturkolben wird in einen programmierbaren Inkubator gestellt, der auf 10 °C und 50 U/min eingestellt ist. Programmieren Sie den Inkubator so, dass er am frühen Morgen des nächsten Tages auf 200 U/min und 37 °C umschaltet.
- Messen Sie OD600 an 1 ml Bakterienkultur in einer Kunststoffspektrometerküvette. 400 μl 1 M IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid) Stammlösung (bei -20 °C gehalten) zugeben, wenn OD600 einen Wert von etwa 1,0 erreicht, um die Expression des rekombinanten Tau-Proteins zu induzieren.
- Die Inkubation bei 37 °C für weitere 3 Stunden fortsetzen. Die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 20 min sammeln.
- Frieren Sie das Bakterienpellet bei -20 °C ein. Bewahren Sie es bis zum Reinigungsschritt ein, bei Bedarf auch über einen längeren Zeitraum.
>2. Reinigung von 15N, 13C-Tau (Abbildung 2)
- Autoklaven-Kationenaustauscher-Reinigungspuffer (CEX) bei 121 °C unter 15 psi für 20 Minuten. Puffer bei 4 °C lagern.
- Tauen Sie das Bakterienzellpellet auf und resuspendieren Sie es gründlich in 45 ml Extraktions-CEX A-Puffer (50 mM NaPi-Puffer, pH 6,5, 1 mM EDTA), frisch ergänzt mit Proteasehemmer-Cocktail 1x (1 Tablette) und DNAseI (2.000 Einheiten).
- Zerkleinern Sie die Bakterienzellen mit einem Hochdruck-Homogenisator bei 20.000 psi. 3-4 Durchgänge sind erforderlich. Zentrifugieren Sie 40 Minuten lang bei 20.000 x g, um unlösliches Material zu entfernen.
- Den Bakterienzellextrakt 15 min bei 75 °C im Wasserbad erhitzen.
HINWEIS: Nach einigen Minuten wird ein weißer Niederschlag beobachtet.
- Bei 15.000 x g für 20 min zentrifugieren und den Überstand mit dem hitzestabilen Tau-Protein aufbewahren.
- Bei Bedarf bis zum nächsten Reinigungsschritt bei -20 °C lagern.
- Führen Sie eine Kationenaustauschchromatographie an einem starken CEX-Harz durch, das als 5-ml-Bettsäule mit einem schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie-System (FPLC) verpackt ist (Abbildung 3 A).
- Stellen Sie die Durchflussmenge auf 2,5 ml/min ein.
- Äquilibrieren der Spalte im CEX A-Puffer
- Befüllen Sie den 60-70 ml erhitzten Extrakt, der Tau enthält, je nach System mit einer Probenpumpe oder alternativ mit Pumpe A. Sammeln Sie den Durchfluss für die Analyse, um zu überprüfen, ob das Tau-Protein effizient an das Harz bindet (siehe 2.8).
- Waschen Sie das Harz mit CEX A-Puffer, bis die Extinktion bei 280 nm wieder auf dem Ausgangswert liegt.
- Eluieren Sie Tau aus der Säule unter Verwendung eines dreistufigen NaCl-Gradienten, der durch eine allmähliche Erhöhung des CEX B-Puffers (CEX A-Puffer mit 1 M NaCl) erhalten wird. Programmieren Sie den FPLC wie folgt: der erste Schritt des Gradienten zu 25 % CEX B-Puffer in 10 Spaltenvolumina (CV), um 250 mM NaCl zu erreichen, der zweite Schritt zu 50 % CEX B-Puffer in 5 CV, um 500 mM NaCl zu erreichen, und der dritte Schritt zu 100 % CEX B-Puffer in 2 CV, um 1 M NaCl zu erreichen. Sammeln Sie 1,5 ml Fraktionen während der Elutionsschritte.
- Analysieren Sie 10 μl der Fraktionen, die während des Elutionsschritts durch SDS-PAGE (12 % SDS-Acrylamid-Gel) und Coomassie-Färbung gesammelt wurden (Abbildung 3 A). Überprüfen Sie auch den Ladeschritt auf der Säule, indem Sie 10 μl des Durchflusses analysieren.
- Wählen Sie die Fraktionen aus, die Tau enthalten, und fassen Sie diese Fraktionen für den nächsten Schritt zusammen.
- Führen Sie einen Pufferaustausch für Tau-haltige gepoolte Fraktionen durch (Abbildung 3 B).
- Eine Entsalzungssäule mit 53 ml G25-Harzbett (26 x 10 cm) in 50 mM Ammoniumbicarbonat (flüchtiger Puffer) wird mit einem FPLC-System äquilibriert.
- Stellen Sie die Flussrate auf 5 ml/min ein. Injizieren Sie die Tau-Probe über eine 5-ml-Injektionsschlaufe auf die Säule. Sammeln Sie Fraktionen, die dem Absorptionspeak bei 280 nm entsprechen.
- Wiederholen Sie die Injektion 3-4 Mal, abhängig vom Volumen des anfänglichen CEX-Pools.
- Berechnen Sie die Menge des gereinigten Tau-Proteins anhand des Peakbereichs des Chromatogramms bei 280 nm (1 mg Tau entspricht 140 mAU*ml).
Anmerkung: Der Extinktionskoeffizient des Tau-Proteins bei 280 nm beträgt 7.550 M-1 cm-1. Tau enthält keine Trp-Rückstände.
- Bündeln Sie alle Tau-Fraktionen.
- Die Probe wird in Röhrchen mit einem Äquivalent von 1 bis 5 mg Tau aliquotiert. Wählen Sie diese Röhrchen so, dass das Volumen der Lösung im Vergleich zum Volumen des Röhrchens klein ist (z. B. 5 ml Lösung in einem 50-ml-Röhrchen).
- Stanzen Sie mit einer Nadel Löcher in die Röhrchenkappen. Tau-Proben bei -80 °C einfrieren.
- Lyophilisieren Sie Tau-Proben. Lyophilisiertes Tau-Protein kann über lange Zeiträume bei -20 °C aufbewahrt werden.
>3. In vitro Phosphorylierung von 15N-Tau
- 5 mg lyophilisiertes Tau werden in 500 μl Phosphorylierungspuffer (50 mM Hepes·KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl) gelöst.
- 2,5 mM ATP (25 μl 100 mM Stammlösung, gehalten bei -20 °C), 1 mM DTT (1 μl 1 M Stammlösung, aufbewahrt bei -20 °C), 1 mM EGTA (2 μl einer 0,5 M Stammlösung), 1x Proteaseinhibitor-Cocktail (25 μl eines 40x Stammes, erhalten durch Auflösen von 1 Tablette in 1 ml Phosphorylierungspuffer) und 1 μM aktiviertes His-ERK2 (250 μl in Konservierungspuffer 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl und 10 % Glycerin, gelagert bei -80 °C) in einem Gesamtprobenvolumen von 1 ml.
Anmerkung: Das aktivierte His-ERK2 kann durch Phosphorylierung mit der MEK-Kinase im eigenen Haus hergestellt werden.
- 3 Stunden bei 37 °C inkubieren.
- Die Probe wird 15 Minuten lang auf 75 °C erhitzt, um die ERK-Kinase zu inaktivieren.
- Bei 20.000 x g 15 min zentrifugieren. Den Überstand auffangen und aufbewahren.
- Entsalzen Sie die Proteinprobe in 50 mM Ammoniumbicarbonat mit einer Säule von 3,45 ml G25-Harz (1,3 x 2,6 cm), die für eine 1-ml-Probe geeignet ist.
- Führen Sie eine 12%ige SDS-PAGE mit 2,5 μl der Proteinprobe durch, um sowohl deren Integrität als auch die effiziente Phosphorylierung zu überprüfen (Abbildung 4).
- Lyophilisieren Sie die phosphorylierte Tau-Probe. Lagern Sie das Pulver bei -20 °C.
>4. Erfassung von NMR-Spektren (Abbildung 5)
- Solubilisieren Sie 4 mg lyophilisiertes 15N, 13C ERK-phosphoryliertes Tau in 400 μl NMR-Puffer (50 mM NaPi oder 50 mM deuteriertes Tris-d11). Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA und 1 mM DTT).
- 5% D2O für die Feldsperrung des NMR-Spektrometers und 1 mM TMSP (3-(Trimethylsilyl)propion-2,2,3,3-d 4-Säure-Natriumsalz)) als interne NMR-Signalreferenz hinzufügen. 10 μl einer 40-fachen Stammlösung eines vollständigen Proteasehemmer-Cocktails zugeben.
- Übertragen Sie die Probe mit einer elektronischen Spritze mit einer langen Nadel oder einer Pasteurpipette in ein 5-mm-NMR-Röhrchen. Verschließen Sie den NMR-Schlauch mit dem Kolben. Entfernen Sie alle Luftblasen, die durch Kolbenbewegungen zwischen dem Kolben und der Flüssigkeit eingeschlossen sind.
- Setze den NMR-Schlauch in einen Spinner ein. Stellen Sie die vertikale Position im Spinner mit dem für den verwendeten NMR-Sondenkopf geeigneten Messgerät so ein, dass sich der größte Teil der Probenlösung in der NMR-Spule befindet.
- Starten Sie den Luftstrom: Klicken Sie im Fenster des Magnetsteuerungssystems auf Lift. Platzieren Sie den Spinner vorsichtig mit dem Rohr im Luftstrom oben an der Magnetbohrung. Stoppen Sie den Luftstrom (Click-Lift) und lassen Sie den Schlauch in den Sondenkopf im Magneten absinken.
- Stellen Sie die Temperatur auf 25 °C (298 K) ein.
- Führen Sie eine halbautomatische Abstimmung und Anpassung des Tastkopfes durch, um die Kraftübertragung zu optimieren. Geben Sie atmm in die Befehlszeile ein.
- Sperren Sie die Spektrometerfrequenz mit dem D2O-Signal der auf dem Deuteriumkanal aufgezeichneten Probe. Klicken Sie im Fenster des Magnetsteuerungssystems auf Sperren.
- Starten Sie den Shimming-Vorgang, um die Homogenität des Magnetfelds an der Position der Probe zu optimieren. Geben Sie topshim gui in die Befehlszeile ein, um das Shim-Fenster zu öffnen. Klicken Sie im Shim-Fenster auf Start. Überprüfen Sie den Restwert der B0-Standardabweichung, um sicherzustellen, dass die Unterlegscheiben optimal sind (weniger als 2 Hz ist gut).
- Kalibrieren Sie den p1-Parameter (Länge eines Protonen-Hochfrequenzpulses in μsec), der notwendig ist, um eine 90°-Drehung der Protonenspins zu erhalten. Streben Sie den 360°-Puls mit einem 1D-Spektrum von Wasserprotonen an (Abbildung 6).
- Passen Sie den Frequenzversatz an, indem Sie den Parameter o1 (in Hz) auf die Protonenwasserfrequenz im 1D-Spektrum einstellen (Abbildung 6).
- Starten Sie die Erfassung eines 1D-Protonenspektrums (Pulssequenz mit Watergate-Sequenz zur Unterdrückung von Wassersignalen, z. B. zggpw5), um die Signale der Probe zu verifizieren (Abbildung 7). Passen Sie die Anzahl der Scans an die relative Proteinkonzentration an. Geben Sie zg in die Befehlszeile ein, um die Erfassung zu starten.
