>1. Arbeitskonzentration der Reaktionskomponenten
- Bereiten Sie die Arbeitskonzentrationen der Puffer für CD frisch vor und halten Sie sie bei 4 °C, bevor Sie die Reaktionen einleiten.
Anmerkung: Für die in dieser Arbeit beschriebenen CD-Reaktionen sind die Arbeitskonzentrationen der Komponenten wie folgt: Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
>2. Auswahl und Vorbereitung von CD-Küvetten
- Sammeln Sie CD-Spektren in hochtransparenten Quarzküvetten. Verwenden Sie rechteckige oder zylindrische Küvetten.
Anmerkung: Für alle in dieser Arbeit beschriebenen Reaktionen wurde eine CD-Quarzküvette (Nennvolumen von 0,4 mL, Weglänge von 1 mm) verwendet.
- Verwenden Sie eine Küvettenreinigungslösung, um die Küvette zu reinigen. Geben Sie 1 %ige Küvettenreinigungslösung in Wasser, um 400 μl der Lösung herzustellen, gießen Sie sie in die Küvette und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C.
- Waschen Sie die Küvette mehrmals mit Wasser, um die Küvette zu reinigen. Scannen Sie das Wasser oder den Puffer in der Küvette, um zu überprüfen, ob sie sauber ist.
Anmerkung: Das Wasser oder der Puffer muss einen Messwert im Bereich von 0 bis 1 mdeg liefern.
>3. Herstellung von Proteinen und DNA-Oligonukleotiden
- Halten Sie das Volumen des Proteins in der Reaktion unter 50 μl, um die Mengen der Pufferkomponenten zu minimieren, die manchmal die Bildung mehrdeutiger Peaks verursachen. Lassen Sie das Protein während des gesamten Experiments auf dem Eis, um einen Abbau zu vermeiden.
- Verwenden Sie PAGE-gereinigte DNA-Oligonukleotide in den Reaktionen.
Anmerkung: Bei den hier beschriebenen Reaktionen wurde DNA sowohl in nativer als auch in hitzegekühlter Form (schnellgekühlt (FC) und langsam gekühlt (SC)) verwendet. Die schnelle Abkühlung fördert die intramolekulare Bindung in der DNA, wodurch mehr Sekundärstrukturen entstehen. Im Gegensatz dazu fördert die langsame Abkühlung die intermolekulare Bindung in der DNA, was zu weniger Sekundärstrukturen führt.
- Für eine schnelle Abkühlung erhitzen Sie DNA 3 Minuten lang bei 94 °C auf dem Heizblock und kühlen Sie ihn sofort auf Eis ab. Für eine langsame Abkühlung erhitzen Sie die DNA 3 Minuten lang auf 94 °C und lassen Sie sie mit einer Geschwindigkeit von 1 °C pro Minute auf Raumtemperatur abkühlen.
>4. Einrichten von Kontrollexperimenten zur Aufzeichnung der Basisspektren
- Halten Sie das Reaktionsvolumen bei allen Reaktionen bei 300 μl. Richten Sie insgesamt 5 Ausgangsreaktionen in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen nacheinander wie folgt ein: i) Puffer + Wasser; ii) Puffer + MgCl2 + ATP + Wasser; iii) Puffer + MgCl2 + ATP + Protein + Wasser; iv) iii + EDTA oder ADAADiN; v) Puffer + Protein + Wasser.
>5. Einrichten der Experimente zur Aufzeichnung von CD-Spektren
- Richten Sie insgesamt 5 Reaktionen nacheinander in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen wie folgt ein: i) Puffer + DNA + Wasser; ii) Puffer + DNA + MgCl2 + ATP + Wasser; iii) Puffer + DNA + MgCl2 + ATP + Protein + Wasser; iv) iii + EDTA oder ADAADiN; v) Puffer + DNA + Protein + Wasser.
>6. Scan aufzeichnen
- Schalten Sie das Gas ein und schalten Sie das CD-Spektrometer ein.
- Schalten Sie die Lampe nach 10-15 min ein. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Haltertemperatur auf 37 °C ein.
- Öffnen Sie die CD-Spektrum-Software.
- Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein.
- Stellen Sie den Wellenlängenbereich auf 180 - 300 nm ein.
- Stellen Sie die Zeit pro Punkt auf 0,5 s ein.
- Legen Sie die Scannummer auf 5 fest.
- Klicken Sie auf Pro-Data Viewer, erstellen Sie eine neue Datei und benennen Sie sie mit Details zum Experiment und zum Datum um.
- Bewahren Sie alle Reaktionskomponenten auf Eis auf, um eine Degradation zu vermeiden. Machen Sie die Baselines und Reaktionen nacheinander in Zentrifugenröhrchen und mischen Sie sie durch Pipettieren. Füllen Sie das Reaktionsgemisch vorsichtig in die Küvette und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen.
- Wenn Sie ein Zeitverlaufsexperiment durchführen, inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 °C für die erforderliche Zeit und führen Sie den Scan durch. Geben Sie EDTA zu dem Puffer, der die DNA, ATP, Mg+2 und das Protein enthält, um die ATP-Hydrolyse zu stoppen.
- Erhöhen Sie die Konzentration von EDTA und seine Inkubationszeit, um die ATPase-Aktivität vollständig zu hemmen.
- Subtrahieren Sie die Basislinien von den entsprechenden Reaktionen in der Software (z. B. subtrahieren Sie Reaktion 1 von der Ausgangslinie 1). Glätten Sie die Daten entweder in der CD-Spektrum-Software oder in der Datenplot-Software. Plotten Sie die Daten in der Datenplot-Software.
Anmerkung: Subtrahiert man die Baselines von den entsprechenden Reaktionen, erhält man die Netto-CD-Spektren nur von DNA.
>7. Datenanalyse und -interpretation
- Verwenden Sie die Formel von Gl (1), um die erhaltenen Werte in Milligrad in die mittlere Restelliptizität umzurechnen.
Dabei ist S das CD-Signal in Milligrad, c die DNA-Konzentration in mg/ml, mRw die mittlere Restmasse und l die Weglänge in cm.
- Erstellen Sie mit der Datenplotting-Software ein Diagramm gegen die Wellenlänge und die mittlere Restelliptizität und analysieren Sie die Peaks.
- Um das Diagramm zu zeichnen, wählen Sie die mittlere Restelliptizität auf der Y-Achse und die Wellenlänge auf der X-Achse aus, und zeichnen Sie ein geradliniges Diagramm.
Anmerkung: Diese Grafik zeigt die charakteristischen Peaks verschiedener DNA-Formen. Die DNA-Formen, die den Peaks entsprechen, können mit Hilfe der vorhandenen Literatur identifiziert werden.