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>1. UV-Vis/Raman-Sonden vorbereiten
- Bereiten Sie die nackte AuNP-Lösung vor
- Bereiten Sie eine 2 ml Lösung von AuNPs mit einer Konzentration von ca. 1 x 1011 Partikeln pro ml vor.
- Wenn die AuNP konzentriert werden müssen, Zentrifugenröhrchen mit geringer Bindung mit 2.000 μl Stamm-AuNP füllen und bei 5.000 x g für 20 min oder bis der Überstand klar ist, zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und achten Sie darauf, das AuNP-Pellet nicht zu stören.
- Kombinieren Sie die verbleibenden AuNP-Lösungen in einem Röhrchen und schätzen Sie die Konzentration, indem Sie eine UV-Vis-Messung durchführen und die Werte mit bekannten Konzentrationen vergleichen, da dies eine lineare Beziehung ist.
- Bestimmen Sie das geeignete Kennzeichnungsverhältnis des Raman-Reporters
- Bereiten Sie eine Arbeitslösung des in Methanol gelösten Raman-Reporters vor. Diese Konzentration hängt vom verwendeten Reporter ab. In dieser Arbeit wird 3,3'-Diethylthiatricarbocyaniniodid (DTTC) in einer Arbeitslösung von 200 μM hergestellt.
- Unter der Annahme eines Endvolumens von 100 μl für jede Vertiefung geben Sie so viel von der Arbeitsreporterlösung in jede Vertiefung der ersten Reihe einer 96-Well-Platte, dass die Konzentrationen des Raman-Reporters zwischen 0,2 μM und 10 μM liegen. Geben Sie so viel Wasser in HPLC-Qualität in jede Vertiefung, dass das Volumen 80 μl beträgt. Fügen Sie jeder Vertiefung 20 μl AuNP hinzu, um ein endgültiges Volumen zu erhalten von 100 μl für jede Vertiefung. Ein Beispiel ist in Tabelle 1 aufgeführt.
- Messen Sie die UV-Vis-Spektren von 400 bis 700 nm mit einem plattenablesbaren UV-Vis-Spektralphotometer. Die geeignete Konzentration ist die höchste Konzentration mit definierten Peaks für die UV-Vis-Spektren. Schritt 2.2.2 wird bei steigenden Konzentrationen wiederholt, bis das höchste Konzentrationsverhältnis von Raman-Reportern zu AuNPs gefunden wird.
Anmerkung: Der Farbstoff und die AuNP-Form, -Größe und -Hersteller beeinflussen die geeignete Konzentration. Daher müssen die aufgeführten Schritte in Abhängigkeit von den verwendeten Komponenten evaluiert und geändert werden. Dieses Protokoll beinhaltete die Verwendung eines positiv geladenen Farbstoffs. Daher wurde die Bindung zwischen dem AuNP und dem Reporter durch die Verwendung negativ geladener AuNPs verbessert. Dies geschah unter Verwendung von Citrat-gedeckelten AuNPs. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Diskussion.
- Bindung von Raman-Reporter und PEG-Ab an AuNP
- Bereiten Sie zwei 1,5-ml-Chargen AuNP und Raman-Reporter in der zuvor festgelegten Konzentration vor, so dass der Raman-Reporter 30 Minuten lang bei Raumtemperatur an die AuNPs binden kann.
- Fügen Sie den PEGylierten Antikörper (PEG-Ab) zu einer Charge der AuNP- und Raman-Reporterlösung hinzu, um ein Verhältnis von Antikörpern zu Partikeln von 200:1 zu erzeugen. Diese Lösung gilt für die Testmuster. In einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen wird das PEGylierte Antigen in die andere Charge der AuNP- und Raman-Reporterlösung in einem Verhältnis von 200:1 von Antikörper zu Partikeln gegeben, die als Kontrolle verwendet werden sollen. Inkubieren Sie die Lösungen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Das Verhältnis von Antikörpern zu Partikeln ist spezifisch für die verwendeten AuNPs und den verwendeten Farbstoff und sollte für jeden Einzelfall optimiert werden. Ziel ist es, ein möglichst hohes Verhältnis an Antikörpern zu haben, an die die AuNP-Sonden binden können, während gleichzeitig eine Aggregation der Partikel verhindert wird. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die geeigneten Volumina zu bestimmen, die addiert werden sollen:
wobei V das Volumen und C die Konzentration ist, ausgedrückt in Partikeln oder Antikörpern pro ml. Das endgültige Volumen sollte ca. 1,5 ml betragen.
- Blockieren Sie die verbleibenden Stellen auf der AuNP-Oberfläche mit mPEG-SH.
- Bereiten Sie mPEG-SH vor, indem Sie festes Methoxypolyethylenglykolthiol mit Wasser auf eine Konzentration von 200 μM auflösen. Die Lösung so lange vortexen, bis sich mPEG-SH vollständig aufgelöst hat.
- mPEG-SH wird in einem Verhältnis von 40.000:1 zu der in Schritt 2.3 hergestellten AuNP-PEG-Ab-Lösung gegeben. Inkubieren Sie die Lösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass die verbleibenden Stellen auf dem Goldnanopartikel blockiert sind. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die geeigneten Volumina zu bestimmen, die addiert werden sollen:
wobei V das Volumen und C die Konzentration ist, ausgedrückt in Partikeln oder Antikörpern pro ml. Das endgültige Volumen sollte ca. 1,5 ml betragen.
- Stellen Sie funktionalisierte Raman-Sonden wieder her.
- Zentrifugieren Sie die Partikel mit 5.000 x g für 20 min in Zentrifugenröhrchen mit geringer Bindung oder bis der Überstand klar ist. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren, wobei darauf zu achten ist, dass die AuNPs nicht gestört werden.
- Resuspendieren Sie die Partikel mit 1 ml 1x PBS-Lösung, die zuvor hergestellt wurde. Schätzen Sie die AuNP-Konzentration, indem Sie eine UV-Vis-Messung eines kleinen Lösungsvolumens (3 μl) durchführen, und vergleichen Sie die Ergebnisse mit Messungen einer bekannten AuNP-Konzentration. Stellen Sie das Volumen so ein, dass die endgültige Lösung mindestens 1 x 1011 Partikel pro ml beträgt.
- Lösungen werden bei 4 °C gelagert, bis sie zur Funktionalisierung der Immunoassay-Platte verwendet werden. Verwenden Sie die Lösungen innerhalb einer Woche.
Tabelle 1. Beispiel für eine DTTC-Verdünnung. Verschiedene Verdünnungen von DTTC und die zugehörigen Volumina von Stamm-DTTC, Goldnanopartikellösung und Wasser.
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| Hinzuzufügende Volumina jeder Komponente (ml) |
| DTTC-Endkonzentration (mM) | DTTC-Arbeitslösung (200 mM) | AuNP | Wasser |
| 0,2 | 0,1 | 20 | 79,9 |
| 0,6 | 0,3 | 20 | 79,7 |
| 1 | 0,5 | 20 | 79,5 |
| arabische Ziffer | 1,0 | 20 | 79 |
| 5 | 2,5 | 20 | 77,5 |
| 7 | 3,5 | 20 | 76,5 |
| 10 | 5,0 | 20 | 75 |
2. Vorbereitung von Immunoassay-Platten
- Binden Sie das gewünschte Antigen an die Immunoassay-Platte.
- Bereiten Sie genügend verdünnte Antigene (50 μg/ml) vor, um die Polystyrol-Wells zu füllen. Wirbeln Sie die Lösung vor und geben Sie die Lösung sofort in die Plattenmulden. Lassen Sie das Antigen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur an die Platten binden.
- Ungebundene Antigene abwaschen.
- Entfernen Sie die überschüssige Antigenlösung, indem Sie die Lösung in einen Entsorgungsbehälter kippen und die Platte gegen eine mit Papiertüchern bedeckte Tischplatte schlagen.
- Geben Sie TBST in die Vertiefungen, um die Oberfläche zu waschen, und entfernen Sie die Wäsche dann auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Mal.
- Blockieren Sie die verbleibenden Bindungsstellen auf der Platte, um unspezifische Bindungen zu verhindern.
- 70 μl HSA-Blockierungslösung in jede Vertiefung der Platte geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen und spülen Sie die Platte mit dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.2 beschrieben. Den Teller abdecken und bis zur weiteren Verwendung trocken bei 4 °C lagern.
- Funktionalisieren Sie die Immunoassay-Platte.
- Geben Sie 70 μl der in Abschnitt 2 hergestellten Sonden-Nanopartikel in die erste Säule einer 96-Well-Platte und verdünnen Sie die nachfolgenden Säulen mit einer seriellen Verdünnung von 1:2. Lassen Sie die Platte mindestens 1 Stunde inkubieren. Ein Beispiel für die Vorbereitung der Immunoassay-Platte ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Waschen Sie die Platte fünfmal mit TBST, wie in Schritt 3.2 beschrieben, und achten Sie darauf, die AuNPs ordnungsgemäß zu entsorgen. Nach der letzten Wäsche 70 μl 1x PBS in jede Vertiefung geben und mit einer Plattenversiegelung abdecken.
HINWEIS: Die Kontrollproben sollten klar sein. Wenn die unspezifische Bindung aufgetreten ist, haben die Kontrollproben eine ähnliche Farbe wie die Testproben.
- Testen Sie die Empfindlichkeit des Assays durch UV-Vis- und Raman-Spektroskopie.
- Messen Sie für jede Vertiefung die UV-Vis-Spektren im Bereich von 400 bis 700 nm mit einem plattenablesbaren UV-Vis-Spektralphotometer.
- Fokussieren Sie das Objektiv mit einem inversen Raman-Mikroskop auf die Oberfläche des Wells, in dem sich die AuNP-Sonden befinden. Erhalten Sie Raman-Spektren des Bohrlochs. Sammle ein Spektrum von 1.800 cm-1 bis 400 cm-1. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Vertiefungen.
- Führen Sie mit geeigneter Spektralsoftware eine polynomiale Basislinienkorrektur 11. Ordnung für die Raman-Spektren und ein Polynom 3. Ordnung für die UV-Vis-Spektren durch.
- Normalisieren Sie mit geeigneter Spektralsoftware die Raman- und UV-Vis-Spektren. Legen Sie den Maximalwert auf 1 fest, und skalieren Sie alle anderen Werte entsprechend. Um die Raman-Spektren zu normalisieren, wählen Sie einen eindeutigen Polystyrol-Peak aus, setzen Sie ihn auf 1 und skalieren Sie alle anderen Werte entsprechend.
- Führen Sie mit der entsprechenden Spektralsoftware eine Peak-Integration für jedes Spektrum durch. Für Raman-Spektren muss sich der Peak, der den Raman-Reporter darstellt, in einer Region befinden, in der es keine Polystyrol-Peaks gibt. Um eine Peak-Integration durchzuführen, geben Sie die integralen Grenzen für den gewünschten Peak an und zeichnen Sie den gewünschten Peakbereich für alle Proben einschließlich der Kontrollen auf.
- Plotten Sie den durchschnittlichen Peak-Interessenbereich als Funktion des Logarithmus der AuNP-Konzentration mit Fehlerbalken für jeden Punkt, der die zugehörige Standardabweichung angibt. Passen Sie diese Kalibrierpunkte an eine logistische Kurve mit 4 Parametern an.
- Bestimmen Sie den Mittelwert des Blindwerts, indem Sie den Mittelwert des Bereichs des interessierenden Peaks für eine Blindprobe bilden. Bestimmen Sie die Standardabweichung dieser Bereiche; Dies ist die Standardabweichung des Rohlings.
- Ermitteln Sie für denselben Peak, der im vorherigen Schritt analysiert wurde, die Standardabweichung dieses Peakbereichs für die niedrigste Konzentration.
- Berechnen Sie die Grenze der Blind- und unteren Nachweisgrenze, wie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse angegeben. Verwenden Sie diese Werte mit den 4PL-Kalibrierkurven, um den LLOD in Bezug auf die AuNP-Konzentration zu bestimmen.
