Eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Proteinen interagieren zu induzieren Zellen auf verschiedene Zell-Schicksal während der Entwicklung zu nehmen. Hier zeigen wir die Verwendung eines in-ovo-Vorbereitung auf mögliche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen in der Entwicklung, indem sie Perlen auf E2.5 Hühnerembryonen Adresse.
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Methodenartikel
Platzieren Growth Factor-Coated Perlen auf Early Stage Hühnerembryonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Neuralrohr drückt viele Proteine in bestimmten raumzeitlichen Muster während der Entwicklung. Diese Proteine haben gezeigt, dass entscheidend sein für die Zell-Schicksal Bestimmung, Zellwanderung, Bildung von neuronalen Schaltkreisen. Neuronale Induktion und Musterbildung beteiligt knochenmorphogenetisches Protein (BMP), Sonic Hedgehog (SHH), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), unter anderem. Insbesondere ist das Expressionsmuster von Fgf8 in unmittelbarer Nähe zu Regionen zum Ausdruck BMP4 und SHH. Dieser Ausdruck Muster steht im Einklang mit Entwicklungsstörungen Interaktionen, die Strukturierung erleichtern im Telencephalon.
Hier bieten wir eine bildliche Darstellung eines Verfahrens, in dem ein in-ovo-Herstellung verwendet werden, um die Auswirkungen von FGFs bei der Bildung des Vorderhirns getestet werden können. Beads sind mit Protein beschichtet und in den Entwicklungsländern Neuralrohr Gegen dauerhafte bieten. Da das Verfahren verwendet kleine, sorgfältig platzierten Perlen, ist es minimal-invasiv und erlaubt mehrere Perlen in einer einzigen Neuralrohr platziert werden. Darüber hinaus erlaubt das Verfahren für die weitere Entwicklung, so dass Embryonen in einem reiferen Stadium untersucht werden kann, um Veränderungen in der Anatomie und in neuronalen Mustern zu erkennen. Diese einfache, aber nützliche Protokoll ermöglicht Echtzeit-Bildgebung. Es bietet die Möglichkeit, räumlich und zeitlich begrenzten Änderungen an endogene Protein-Ebene zu machen.
Protokoll
1. Entfernen Sie Eier aus dem Inkubator
Bei E2-2.5 (~ St. 17 HH), entfernen Sie die Eier und bereiten sie entsprechend. Sie können sofort oder arbeitete wieder in den Inkubator für ein paar Stunden. Die Eier können bei Raumtemperatur vorgelegt sicher über eine Stunde. Eier können draußen bleiben für die Dauer der Manipulationen. Manchmal sind diese kann eine Stunde oder mehr.
Hinweis: Je länger sie sitzen bei Raumtemperatur, desto weniger wahrscheinlich werden sie überleben.
2. Vorbereitung der Tusche
- Bereiten Sie eine frische Lösung von 4% Tusche in sterile PBS.
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Diskussion
Je nach Protein, das Sie verwenden möchten, gibt es verschiedene Protokolle, wie die Perlen vorzubereiten. In diesen Experimenten verwenden wir Heparin-Acryl-Perlen, aber Affi-Gel-Kügelchen können ebenfalls verwendet werden. Wir haben festgestellt, dass die Heparin-Acrylperlen einfacher, in der wässrigen Umgebung des Eieralbumin zu manipulieren sind. Beads sind in 5 l Protein über Nacht bei 4 ° C eingeweicht Control-Kügelchen werden in sterile PBS bis zum Zeitpunkt der Platzierung gelegt. Der Vorteil in der Verwendung eines in-ovo-Zubereitu.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Eier | Tier | Befruchtet, E2-2,5 (~ St. 17 HH) | ||
| Brutschrank | Profi-I | Lyon | ||
| Indiatinte | Werkzeug | Higgins | Eine 4%ige Lösung in steriler PBS herstellen. | |
| Sterile PBS | Alternativ kann ein Antikörperserum verwendet werden | |||
| 1-ml-Spritze | ||||
| 27G 1/2-Nadeln | Werkzeug | BD Biosciences | 305109 | Im 90-Grad-Winkel abgewinkelt |
| Pinzette | Werkzeug | World Precision Instruments, Inc. | Größe 55 | |
| Blutstillungszange | ||||
| Präzisionsschere | Werkzeug | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | Vannas, 8,5 cm |
| Parafilm-Band | zum Versiegeln der Eier | |||
| Wolframsonde | Werkzeug | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Werkzeug #24. Griff optional. |
Referenzen
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
