Ein leistungsfähiges Modell für perioperative und Intensivmedizin akute Nierenversagen wird vorgestellt. Mit ganzen Körper Hypoperfusion durch Herzstillstand ist es möglich, fast replizieren die histologische und funktionelle Veränderungen der klinischen AKI induziert.
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Methodenartikel
Normothermen Herzstillstand und Herz-Lungen: Ein Maus-Modell der Ischämie-Reperfusionsschaden
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Akute Nierenschädigung (AKI) ist ein verbreitetes, hoch tödliche Komplikation der kritischen Erkrankung, die eine hohe Mortalität 1-4 und die am häufigsten von Ganzkörper-Hypoperfusion verursacht hat. 5,6 Erfolgreiche Reproduktion des ganzen Körpers Hypoperfusion in Nagermodellen wurde mit Schwierigkeiten verbunden. 7-9,9,10 Models, die fokale Ischämie beschäftigen immer wieder Ergebnisse, die nicht dem klinischen Umfeld, und größere Tiermodelle, die für den ganzen Körper Hypoperfusion keinen Zugang zu den vollständigen Toolset der genetischen Manipulation erlauben übersetzen gezeigt möglich in der Maus. 11,12 Doch in den letzten Jahren einem Mausmodell der Herzstillstand und Reanimation entstanden die zu Modell AKI angepasst werden. 13 Dieses Modell zuverlässig reproduziert physiologische, funktionale, anatomische und histologische Ergebnisse in klinischen AKI gesehen , wird schnell wiederholbar, und bietet alle wichtigen Vorteile einer murinen chirurgischen Modells, einschließlich des Zugangs zu genetischen manipulativen Techniken, niedrige Kosten im Vergleich zu großen Tieren, und Benutzerfreundlichkeit. Unsere Gruppe verfügt über umfangreiche Erfahrungen mit der Anwendung dieses Modells entwickelt, um eine Reihe von Organ-spezifische Ergebnisse in AKI beurteilen. 14,15
Protokoll
Alle beschriebenen Verfahren sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Tieren in der Forschung und allen tierischen Protokolle wurden von der Oregon Health & Science University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses zugelassen wurden.
1. OP-Vorbereitung
- Wiegen Sie die Maus. Das beschriebene Verfahren basiert auf C57BL / 6 Mäuse mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g. durchgeführt Anästhesie ist in einer Induktion Box mit 3-4% Isofluran induziert und anschließend gepflegt mit 1,5-2,5% Isofluran in Luft / Sauerstoff-Gemisch.
- Schmieren Sie die Augen und die Position des Tieres in Rückenlage auf einem Heizkissen. Immobilisieren 4 Extremitäten mit Klebeband. Die Hinterpfoten in einer neutralen Position können abgeklebt werden, jedoch sollte die Vorderpfoten so nahe an der Brustwand befestigt werden, wie möglich, die volle Brustwand Ausflug während der Herzdruckmassage zu ermöglichen.
- Schmieren und legen Sie eine rektale Temperatursonde. Die Temperatur wird mit einem Heizkissen und Lampe an einen elektronischen Temperaturregler (Digi-Sense, Cole Parmer, Vernon Hills IL), die eingestellt auf 37,0 aufrechtzuerhalten ° C. Da es möglich ist, dass ein Temperaturgradient innerhalb des Tier könnte während der No-Flow-Zustand zu entwickeln, ist es wichtig, dass die Temperatur gemessen und gesteuert werden in der Nähe der Orgel von Interesse.
- Intubieren die Luftröhre mit einem 2,5 cm 22 ga Teflonkatheter (Insyte-W, BD, Franklin NJ) und der Schnitt distalen Ende eines abgewinkelten Einführschleuse (Frova Introducer, Cook Medical, Bloomington IN). Andere Methoden der Intubation sind akzeptabel, aber der Winkel Einführschleuse verwenden können richtige Positionierung des Halses in einer leicht gestreckten Position, die chirurgische Exposition für die Platzierung der intravenösen Katheter optimiert. Die endotracheale Katheteransatz ist mit einer Schlaufe des Fadens auf die Schneidezähne gesichert und gepflegt mit leichter Spannung auf den Kopf während der Herzdruckmassage zu immobilisieren.
- Mechanisch entlüften Sie die Maus mit einem Nagetier Ventilator gesetzt bis 140 ul, 150 Atemzüge / Minute. Dies ist nicht für das Gewicht angepasst dieses Protokoll ist immer in 20-25 g Tieren durchgeführt. Nicht zu vertiefen Anästhesie. Setzen Sie nicht das Beatmungsgerät endexspiratorischer Druck, da dies beeinträchtigt Wiederbelebung anzuwenden.
- Mit einer sterilen Technik und ein Operationsmikroskop, setzen Sie ein pre-gespült PE-10 Katheter in die Halsschlagader. Beide Seiten können verwendet werden, sondern Nutzung der Seite, die dem Betreiber verringert die Wahrscheinlichkeit des Katheters Dislokation während der Herzdruckmassage oder sonstige Manipulationen. 0,5% Bupivacain, 0,1 mL in Wundränder infitrated um postoperative Schmerzen zu kontrollieren.
- Befestigen Sie die PE-10 Katheter in der Haut Verschluss mit Cyanacrylat chirurgische Kleber.
- Legen subkutane EKG-Elektroden und eine Verbindung zum Überwachungsgerät. Sorgfältige Aufmerksamkeit auf den Signalweg und die Maximierung des Signals selbst ist entscheidend für den Erfolg der Reanimation. Stellen Sie sicher, dass alle Kabel an das Betriebssystem Oberfläche befestigt sind, zu minimieren Signal Kreuzungen, und minimieren Isolatoren (wie die Luft in Hohlnadeln oder Litze) in den Signalweg. Solide Nadeln verbunden nonstranded Anschlusskabel können gekauft oder gebaut werden, das Labor. Sobald die Verbindung hergestellt, optimieren die EKG-Signal auf dem Monitor.
2. Cardiac Arrest
- Stellen Sie sicher, dass die Maus normothermen ist, definiert als die rektale Temperatur 36,5 ° C - 37,5 ° C. Verwalten 40 ul Raumtemperatur 0,5 M Kaliumchlorid intravenös und beobachten isoelektrischen Ablaufverfolgung auf EKG. Dosisanpassung für das Gewicht ist nicht im Bereich notwendigen 20-25 g. Starten Verhaftung Timer.
- Trennen Sie das Beatmungsgerät. Unterbrechen Sie die Narkose Dampf. Schalten Sie das Heizkissen und anderer Geräte, die elektronische Geräusche, die mit EKG Überwachung beeinträchtigen können produziert. Legen Sie eine isolierende Decke über die Maus.
- Rekord Temperatur jede Minute während Herzstillstand. Wenn nötig, kann eine Wärmelampe zur Kerntemperatur bringen bis zum normothermen Bereich liegen. Während Herzstillstand, bereiten Versorgungsgüter und Ausrüstungsgegenstände (z. B. das Adrenalin-Spritze) für Reanimation. Eine Checkliste kann hilfreich sein, um einen ununterbrochenen Reanimation, die essentiell für das Überleben zu gewährleisten.
- Nach 7 Minuten, 30 Sekunden von Herzstillstand, schließen Sie den Lüfter und die Geschwindigkeit erhöhen, bis 180 Atemzüge / min und hält das Atemzugvolumen bei der Pre-Verhaftung Einstellung.
- In 8 Minuten, initiieren Herzdruckmassage bei 300 BPM. Bewegungsartefakte auf dem EKG können, zu beurteilen, CPR-Rate verwendet werden. Herzdruckmassage sollte mit dem Zeigefinger, 5 mm über dem Schwertfortsatz und leicht nach links von der Mittellinie geliefert werden. Die Brust sollte 1/3-1/2 der sagittalen Abstand komprimiert werden und voll Rückstoß muss zwischen Kompressionen erlaubt. Finger Positionierung und optimale Kompression Druck sind absolut entscheidend. Andernfalls Überleben in diesem Modell zu erreichen, ist fast immer zu suboptimalen CPR.
- Infuse 0,5 ml Epinephrin, verdünnt auf 15 pg / mL, in den ersten 30 Sekunden der CPR. Insgesamt Adrenalin-Dosis liegt bei 8-12 pg. Beachten Sie sorgfältig die EKG für die Rückkehr der spontanen Zirkulation (ROSC). Schmale komplexen QRS-Komplexe liegen zwischen Kompressions-Artefakte zu sehen. ROSC tritt in der Regel zwischen 90 Sekunden und 2 Minuten nach dem Start CPR. Resuscitation wird aufgegeben, wenn ROSC nicht durch 3 Minuten auftreten. Häufige ventrikuläre und Veränderungen in der EKG-Achse sind in den ersten 2 Minuten nach ROSC beobachtet, und fast immer in stetigen Sinustachykardie lösen bei 2 Minuten.
- Rekord Gesamtzeit von Reanimation und Adrenalin-Dosis. Rekord Temperatur jede Minute für 10 Minuten nach ROSC.
- EKG führt, kann entfernt werden, wenn spontane Atmung beginnt, in der Regel innerhalb von 12-15 Minuten nach ROSC.
- Extubieren die Luftröhre, wenn spontane Atemfrequenz> 60/min ist.
- Platzieren Sie die Maus in eine Erholung Käfig auf eine Temperatur gesteuerte Oberfläche eingestellt auf 37 ° C für die ersten 2 Stunden postprocedure, einen einfachen Zugang zu Nahrung und Wasser. Der Käfig kann dann auf Standard postoperative Wohnverhältnisse verschoben werden, wenn die Maus vollständig aus der Narkose erholt und ist aktiv.
3. Blutleere / Perfusion-Fixation-und Nieren-Ernte
- 24 Stunden nach dem CA / CPR, induzieren Narkose mit Isofluran 3-4% und sichern Sie das Tier in Rückenlage auf einer chirurgischen Oberfläche innerhalb einer Abzugshaube, die geeignet für den Einsatz mit Formalin ist ..
- Vertiefung der Narkose durch die schrittweise Erhöhung der Narkose Dampfkonzentration auf 5% und sorgen für die Maus ist tief narkotisierten als durch die Einstellung der Spontanatmung belegt.
- Führen Sie ein Klapphandy Thorakotomie und exsanguinate der Maus über apikalen Punktion des Herzens linken Ventrikels nach Standardverfahren.
- Über die gleiche Nadel, verwalten 0,9% iger Kochsalzlösung durch langsame Infusion. Um Perfusion / Ausbluten acclerate, nick das Recht Herzohr mit einer Schere. Führen Sie eine Laparotomie und beobachten die Nieren. Wenn sie blanchiert werden, können Kochsalzlösung auf 4% Formalin zur Fixierung geändert werden. Nieren sind dann in Paraffin und gefärbt mit Fluoro-Jade-B für die Quantifizierung von röhrenförmigen Epithelnekrose eingebettet.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Wenn CA induziert wird, den mittleren arteriellen Druck (MAP) und regionalen Nierendurchblutung (RRBCF) fallen auf nahezu Null und stabil bleiben, bis Reanimation beginnt (Abbildung 1). 24 Stunden nach dem CA / CPR, Serum-Indizes der Nierenfunktion (Blut-Harnstoff-Stickstoff, Harnstoff und Kreatinin) sind signifikant erhöht gegenüber sham-operierten Tieren. AST / ALT sind ebenfalls erhöht, bietet Hinweise auf tief greifende Ganzkörper-Ischämie (Abbildung 2). Neutrophil-Gelatinase verbundenen Lipocalin (NGAL), ein sensibler Indikator der Nierenfunktion ischämischen Schädigung massiv hochreguliert 24 Stunden nach CA / CPR (Abbildung 3). Schließlich zeigen Mikrophotographien die lückenhafte, medulläre Nekrose typische ischämische Nierenschädigung mit Ausdünnung der Tubulusepithel und luminalen Füllung auf Hämatoxylin und Eosin-Färbung (Abbildung 4, Teil A) und umfangreiche Zelltod in medullären Tubulusepithel, wenn sie mit Fluor-Jade B gefärbt ( Abbildung 4, Teil B).
Abbildung 1. Herzstillstand induziert Instant Verlust der Perfusionsdruck, vertreten hier den mittleren arteriellen Druck (MAP) in der Femoralarterie gemessen, was in nahezu vollständigen Einstellung der regionalen renalen kortikalen Blutflusses (RRCBF) während der Dauer der Herzstillstand (schraffierte Bereich). Reanimation mit Herzdruckmassage und Adrenalin kehrt MAP normal und RRCBF stetig steigt in der post Reanimation Zeitraum. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von 14.
Abbildung 2. 24h postprocedure, Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN), Serum-Kreatinin, und das Ausmaß der röhrenförmigen Zelltod sind alle signifikant erhöht bei Tieren mit CA / CPR im Vergleich zu Tieren mit einem Scheinmedikament behandelten Verfahren unterzogen. CA / CPR induziert eine pan-organismal ischämischen Insult, hier durch massive Erhöhung der Leber-Funktion Enzyme nachgewiesen Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST) in CA / CPR Mäusen mit sham-behandelten Tieren verglichen.
Abbildung 3. Western-Blot unter Verwendung von polyklonalen Antikörper gegen neutrophile Gelatinase-assoziiertes Lipocalin (NGAL), ein sensibler Indikator für die Nierenfunktion ischämischen Schädigung. Urinproben wurden unmittelbar vor ("pre") und 24 Stunden nach ("24h") CA / CPR in 4 Tieren (beschriftet mit a, b, c und d oben) erhalten. NGAL ist massiv in Maus hochreguliertUrin nach CA / CPR. mit freundlicher Genehmigung von 14 Nachdruck.
Abbildung 4. A) Hämatoxylin und Eosin einer kurzen Achse hilären Abschnitt Nierengewebe 24 Stunden nach CA / CPR Fleck. Es ist lückenhaft, aber klar Schäden an Mark-und Rinden-Röhrchen mit röhrenförmigen Einstecken. Pfeile deuten auf beschädigte Röhrchen mit geschwollenen, pyknotische Kerne an der Grenze von Rinde. B) Fluor-Jade B der gleichen Region Fleck in der gleichen Tier 24 Stunden nach CA / CPR. Fluoro-Jade B Flecken abgestorbene Zellen leuchtend grün und zeigt lückenhaft kortikomedulläre Tubulusnekrose. Pfeile zeigen auf hell gefärbt beschädigt Röhrchen an der Grenze von Rinde. Diese Erkenntnisse sind im Wesentlichen ähnlich Nierenbiopsie Erkenntnisse aus Menschen, die AKI entwickeln, und im Gegensatz zu denen von anderen Tiermodellen der AKI produziert.
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Diskussion
Die normothermen Modell Herzstillstand und Reanimation in der Maus bietet eine Vielzahl von Möglichkeiten der Auswertung in einem Modell, welches die Pathophysiologie und Morphologie der häufigste klinische Ursache AKI, Ganzkörper-Hypoperfusion repliziert. Das Testen von Hypothesen kann durch den Zugang zu einer breiten Palette von genetischen Manipulationstechniken und gut verstanden und charakterisiert Anatomie und Physiologie der Labormaus unterstützt werden.
Wie hier beschrieben, ist das...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | |
| Kaliumchlorid | Abbott Medical | 06653-5 | |
| Isofluran | Abbott Medical | 05260-05 (und andere) | |
| Adrenalin HCl | Mehrere | Mehrere | |
| Digi-Sense-Temperaturregler | Cole-Palmer | EW-89000-00 | |
| Angiocath IV Cath | VWR | 381134 | |
| Frova abgewinkelt Atemwege Einführschleuse | Kochen | G27282 | |
| MicroVent Ventilator für Mäuse | Harvard Apparatus | 733591 |
Referenzen
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