Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Zusammenfassung

RNA-Expressionsprofilierung von diskreten Hirnregionen von Mäusen erfordert eine präzise und wiederholbare Gewebeentnahmestrategie. Ein Protokoll, das sowohl koronale Hirnschnitte als auch Gewebekern-assistierte Mikrodissektionen verwendet, wird hier beschrieben. Die Ausbeute und Qualität der Gesamt-RNA, die aus den resultierenden Proben gewonnen wird, bestätigt den Nutzen der beschriebenen Methode.

Zusammenfassung

Als technologische Plattformen sind Ansätze wie Next-Generation-Sequencing, Microarray und qRT-PCR vielversprechend, um unser Verständnis der Breite der molekularen Regulation zu erweitern. Neuere Ansätze wie die hochauflösende RNA-Sequenzierung (RNA-Seq)¹ liefern neue und umfassende Informationen über gewebe- oder zustandsspezifische Expression, wie z. B. relative Transkriptspiegel, alternatives Spleißen und Mikro-RNAs^2-4. Die Aussichten für die Anwendung der RNA-Seq-Methode bei der vergleichenden Erstellung von Gesamttranskriptomprofilen⁵ innerhalb diskreter Gewebe oder zwischen phänotypisch unterschiedlichen Gruppen von Individuen bieten neue Wege zur Aufklärung molekularer Mechanismen, die sowohl an normalen als auch an abnormalen physiologischen Zuständen beteiligt sind. Kürzlich wurde ein vollständiges Transkriptom-Profiling an menschlichem Hirngewebe durchgeführt, um Unterschiede in der Genexpression zu identifizieren, die mit dem Fortschreiten der Krankheit verbunden sind⁶. Der Einsatz von Next-Generation-Sequencing muss jedoch noch in größerem Umfang in Säugetierstudien integriert werden.

Genexpressionsstudien in Mausmodellen haben mit Hilfe der Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) zur Probenexzision unterschiedliche Profile innerhalb verschiedener Hirnkerne berichtet^7,8. Während LCM eine Probenentnahme mit Präzision für Einzelzellen und diskrete Hirnregionen ermöglicht, können die relativ geringen Gesamt-RNA-Ausbeuten des LCM-Ansatzes für RNA-Seq und andere Profiling-Ansätze in Hirngeweben von Mäusen unerschwinglich sein und suboptimale Probenamplifikationsschritte erfordern. Hier wird ein Protokoll für die Mikrodissektion und die Total-RNA-Extraktion aus diskreten Hirnregionen der Maus vorgestellt. Gewebecorer mit festgelegtem Durchmesser werden verwendet, um 13 Gewebe aus 750 μm großen seriellen Koronalesen eines einzelnen Mausgehirns zu isolieren. Gewebe-Micropunch-Proben werden sofort eingefroren und archiviert. Die Gesamt-RNA wird aus den Proben mit Hilfe der magnetischen Bead-fähigen Gesamt-RNA-Isolierungstechnologie gewonnen. Die resultierenden RNA-Proben weisen eine ausreichende Ausbeute und Qualität für die Verwendung in der nachgelagerten Expressionsprofilierung auf. Diese Mikrodissektionsstrategie bietet eine praktikable Option zu bestehenden Probenentnahmestrategien zur Gewinnung von Gesamt-RNA aus diskreten Hirnregionen und eröffnet Möglichkeiten für neue Entdeckungen der Genexpression.

Protokoll

1. Einrichtung und Vorbereitung der Probenahme

1. Ergänzen Sie die Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) mit Natriumbicarbonat (0,44 g pro 100 mL EBSS) und Glukose (0,884 g pro 100 mL EBSS)⁹. Behandeln Sie das EBSS mindestens 12 Stunden lang bei 37 °C in einer autoklavierbaren Flasche oder einem Kolben mit Schraubverschluss mit DEPC (0,1 mL pro 100 mL EBSS).
2. Legen Sie 5 3/4" Glaspasteurpipetten in ein 1000-ml-Glasbecherglas und platzieren Sie Künstlerpinsel mit den Borsten nach oben in einen 100-ml-Messzylinder aus Glas. Fügen Sie ausreichend DEPC-Lösung (0,1 mL pro 100 mL ddH₂O) hinzu, um die Pipetten bzw. Bürsten zu bedeck....

Diskussion

Es gibt viele kritische Schritte in diesem Protokoll, die sorgfältige Aufmerksamkeit und Überlegung erfordern. Die Auswahl des geeigneten Tissue-Corer-Durchmessers muss bestimmt werden, um die jeweilige Region of Interest zu entfernen. Während die in Tabelle 1 dargestellten Gewebecorerdurchmesser für die Entnahme der aufgelisteten Hirnregionen geeignet sind, sollte jeder Untersucher den entsprechend großen Gewebecorer für eine optimale Entnahme seiner jeweiligen Gewebe von Interesse bestimmen. Zweitens wurde experimen.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Isotemp 102 Wasserbad	Fisher Scientific	15-460-3Q
RNase Zap	Ambion	AM9782
Laborrotator (Orbitalschüttler)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314 –- 1CEQ
Pelletmischer	VWR international	47747-370
RNasefreier 0,5 mL Stößel	VWR international	KT749521-0590	Nukleasefreies
Diethylpyrocarbonat (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758-50ML
Doppelschneidige Rasierklingen	Stoelting Co.	51427
St– Tissue-Slicer mit manueller Messschraube	Stoelting Co.	51425
2/0 Runder Künstler' s Bürste	Princeton Art Brush	4350R
Harris Uni-Core Entkerner (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Harris Uni-Core Entkerner (1,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15099
Harris Uni-Core Entkerner (1,5 mm)	Ted Pella, Inc.	15075
Harris Uni-Core Entkerner (2,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15076
Guillotine	Braintree Scientific, Inc.	RG-100
DecapiCones	Braintree Scientific, Inc.	MDC-200
HyClone Earle' s ausgewogene Salzlösung (EBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30029.02
25 mL Pipetten	Corning	4489	Nukleasefreies
epT.I.P.S. LoRetention Dualfilter-Pipettenspitzen, 20 – 300 μ L	Eppendorf	0030 077.636
TrakMates Schraubverschlussrohre mit Verschlüssen	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3741
VisionMate drahtloses 2D-Barcode-Lesegerät	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3122MTX
VisionMate SR 2D-Barcodeleser mit einem Rack	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3115
1-200 μ L Universal Fit Pipettenspitzen	Corning	4864	Nukleasefreie
Cellstar Zellkulturschalen	Greiner Bio-One	628160	Nukleasefrei
Greiner Bio-One 96-Well Polystyrol Cellstar Gewebekulturplatte, U-Boden	USA Scientific, Inc.	5665-0180	Nukleasefrei
#4 Filterpapier	Whatman, GE Healthcare	1004 150
Sicherheitspipettenfüller mit Silikonkolben	Fisher Scientific	13-681-102A
NanoDrop 3300 Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-3300