Die Profilierung der RNA-Expression in diskreten Regionen des Mausgehirns erfordert eine präzise und reproduzierbare Strategie zur Gewinnung von Gewebeproben. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das sowohl die koronare Schnittführung des Gehirns als auch die mikrodissektionsbasierte Gewebeentnahme mithilfe eines Gewebecorers nutzt. Die Ausbeute und Qualität der gesamten RNA aus den resultierenden Proben bestätigt die Eignung der dargestellten Methode.
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Methodenartikel
Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Als technologische Plattformen versprechen Ansätze wie die Next-Generation-Sequenzierung, Microarray- und qRT-PCR-Methoden eine erhebliche Erweiterung unseres Verständnisses der Vielfalt molekularer Regulationsmechanismen. Neuere Ansätze wie die hochauflösende RNA-Sequenzierung (RNA-Seq)1 liefern neue und umfassende Informationen über gewebe- oder zustandsspezifische Expression, beispielsweise über relative Transkriptmengen, alternatives Spleißen und micro-RNAs2–4. Die Anwendung der RNA-Seq-Methode zur vergleichenden Profilierung des gesamten Transkriptoms5 in definierten Geweben oder zwischen phänotypisch unterschiedlichen Gruppen von Individuen eröffnet neue Wege zur Aufklärung der an normalen und pathologischen physiologischen Zuständen beteiligten molekularen Mechanismen. Kürzlich wurde die Profilierung des gesamten Transkriptoms an menschlichem Hirngewebe durchgeführt und dabei Genexpressionsunterschiede identifiziert, die mit dem Fortschreiten von Erkrankungen assoziiert sind6. Die Next-Generation-Sequenzierung ist jedoch bisher noch nicht breiter in die Untersuchungen an Säugetieren integriert worden.
Genexpressionsstudien an Mausmodellen haben unterschiedliche Profile innerhalb verschiedener Hirnkerne mithilfe der Lasermikrodissektion (LCM) zur Probengewinnung berichtet7,8. Obwohl die LCM die Probenentnahme mit Einzelzell- und präziser regionaler Genauigkeit im Gehirn ermöglicht, können die vergleichsweise geringen Gesamt-RNA-Mengen, die mit der LCM-Methode erzielt werden, eine Hemmschwelle für RNA-Seq und andere Profilierungsansätze in Maushirngeweben darstellen und unter Umständen suboptimale Probenvielfachungsschritte erforderlich machen. Hier wird ein Protokoll zur Mikrodissektion und Gewinnung der Gesamt-RNA aus definierten Bereichen des Mausgehirns vorgestellt. Gewebestanzwerkzeuge mit festgelegtem Durchmesser werden verwendet, um 13 Gewebeproben aus 750-μm-seriellen koronaren Schnitten eines einzelnen Mausgehirns zu isolieren. Die mikrochirurgisch entnommenen Gewebeproben werden unverzüglich eingefroren und archiviert. Die Gesamt-RNA wird aus den Proben mithilfe einer Technologie zur RNA-Isolierung unter Verwendung magnetischer Partikel gewonnen. Die resultierenden RNA-Proben weisen eine ausreichende Ausbeute und Qualität für den Einsatz in nachgeschalteten Expressionsanalysen auf. Diese Mikrodissektionsstrategie bietet eine praktikable Alternative zu bestehenden Methoden der Probensammlung zur Gewinnung von Gesamt-RNA aus definierten Hirnregionen und eröffnet neue Möglichkeiten für Entdeckungen im Bereich der Genexpression.
Protokoll
1. Probenahmeaufbau und Vorbereitung
- Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) mit Natriumbicarbonat (0,44 g pro 100 mL EBSS) und Glukose (0,884 g pro 100 mL EBSS) versetzen9. Die EBSS mit DEPC (0,1 mL pro 100 mL EBSS) mindestens 12 Stunden bei 37 °C in einer autoklavierbaren Flasche oder einem Kolben mit Schraubverschluss behandeln.
- Fünf ¾" Glas-Pasteurpipetten in einen 1000-mL-Glaskolben geben und Pinsel mit den Borsten nach oben in einen 100-mL-graduierten Glaszylinder stellen. Soweit DEPC-Lösung (0,1 mL pro 100 mL ddH2O) hinzufügen, dass die Pipetten und Pinsel jeweils bedeckt sind. Den Kolben und den Messzylinder mit Aluminiumfolie abdecken und mindestens 12 Stunden bei 37 °C inkubieren.
- Nach der 12-stündigen Inkubation mit DEPC alle DEPC-behandelten Materialien auf eine Temperatur >100 °C für mindestens 15 Minuten erhitzen. EBSS entfernen und vor der Lagerung bei 4 °C auf Raumtemperatur abkühlen lassen. ddH2O von Kolben und Messzylinder abgießen; weitere Inkubation bei >100 °C fortsetzen, bis die Materialien trocken sind. Anschließend entfernen, auf Raumtemperatur abkühlen lassen und für die spätere Verwendung aufbewahren.
- Am Tag des Experiments alle Arbeitsflächen mit RNaseZap behandeln.
- EBSS am Tag des Experiments in ein Wasserbad gestellt, das auf 40 °C eingestellt ist. Um die EBSS zu puffern und zu oxygenieren, mit 95 %/5 % O2/CO2 durch Einlegen eines Gaszufuhrschlauchs in eine RNase-freie Pasteurpipette und Eintauchen der Pipette in die EBSS infiltrieren. Die Öffnung des EBSS-Behälters abdecken.
- Einen Stoelting-Gewebeschneider zur seriellen Schnittführung des Gehirngewebes vorbereiten. Ober- und Unterseite des Gewebeschneiders mit RNaseZap behandeln. Ein rechteckiges Stück Whatman #4-Filterpapier auf der Plexiglasfläche des Gewebeschneiders befestigen. Eine Doppelschneidklinge am Schneidarm des Schneiders anbringen. Den Mikrometer auf Null stellen und die minimale Höhe des Schneidarms so einstellen, dass die Klinge das Filterpapier, nicht jedoch die Plexiglasplatte schneidet.
- Alle weiteren für die Mikrodissektion benötigten Materialien bereitlegen, einschließlich RNase-freier Zellkulturschalen (60×15 mm), Harris-Uni-Core-Gewebestanzgeräte, 200-μL-RNase-freier Mikropipettenspitzen zur Befestigung an Gasschläuchen zur Sauerstoffversorgung koronaler Gehirnschnitte während des Mikroprobenstechens, gebogener Schere, Trockeneis und Röhrchen zur Gewebesammlung. Die Röhrchen auf Trockeneis stellen.
2. Entnahme des Gehirns und koronare Schnittführung
- Platzieren Sie die Maus in einen DecapiCone und enthaupten Sie sie mithilfe einer Nagetier-Garotte. Entfernen Sie den Kopf aus dem DecapiCone und legen Sie ihn auf eine flache Oberfläche. Schneiden Sie mit einem Skalpell die Haut entlang der Mittellinie des Schädels auf, beginnend etwa 3 mm kaudal der Nasenöffnung. Klappen Sie die Hautlappen seitlich zurück, um den Schädelknochen und die Augenhöhlen freizulegen.
- Schneiden Sie mit einer gebogenen Schere beide Sehnerven durch, um deren Verbindung zum Auge zu trennen. Öffnen Sie die Schädelhöhle, indem Sie vorsichtig das Hinterhaupts- und das Scheitelbein brechen und die dorsalen Scheitel- und Stirnbeine entfernen. Brechen Sie mit einer Knochenzange die Nasen- und Tränenbeine, um die Riechkolben freizulegen. Trennen Sie die Riechkolben mit der gebogenen Schere vom rostralen Gehirn ab. Entfernen Sie das gesamte Gehirn mit intaktem Hinterhirn. Legen Sie das Gehirn in die obere Hälfte einer RNase-freien Zellkulturschale (60 × 15 mm, Cellstar). Überführen Sie es auf die Arbeitsfläche für die Gewebeprobenentnahme.
- Befeuchten Sie vorsichtig das Filterpapier am angeschlossenen Gewebeschneider mit EBSS unter Verwendung einer RNase-freien Pipette. Benetzen Sie das Gehirngewebe mit EBSS.
- Überführen Sie das Gehirn auf den Gewebeschneider und richten Sie es entsprechend aus. Hinweis: Das Gehirn sollte so positioniert sein, dass die ventrale Fläche auf dem Filterpapier aufliegt. Die Mittellinie (Interhemisphärenspalte) sollte senkrecht zur Schneidklinge stehen, und die rostrale Kante des Gehirns sollte an der Klinge anliegen.
- Halten Sie das Gehirn mit einem DEPC-behandelten Pinsel durch leichtes Andrücken auf die dorsale Oberfläche in Position. Halten Sie dabei das Gehirn fest, heben Sie den Klingenhalterhebel etwa 4–5 cm über die dorsale Gewebeoberfläche an und halten Sie ihn in dieser Position. Entfernen Sie den Pinsel von der Gehirnoberfläche und stellen Sie am Mikrometer 750 μm ein. Lassen Sie den Hebel absinken, wodurch das Gewebe durchtrennt wird und ein 750 μm dicker koronaler Schnitt entsteht.
- Während die Schneidklinge stillsteht, streichen Sie vorsichtig mit einer rollenden Bewegung des Pinsels den Gewebeschnitt von der Klinge weg. Legen Sie den Gewebeschnitt unmittelbar in das mit Sauerstoff versetzte EBSS in die Petrischale. Ein zweiter Untersucher kann mit Schritt 3.1 beginnen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6, bis serielle Gehirnschnitte über die gesamte rostrokaudale Ebene gewonnen wurden.
3. Mikrodissektion von Gehirnregionen
- Stellen Sie die Beleuchtung so ein, dass die Probenausleuchtung während der Gewebemikrodissektion nicht behindert wird. Passen Sie Position und Durchfluss der 95 %/5 %-Mischung aus O2/CO2 an, um während der Mikrodissektion ein gepuffertes, mit Sauerstoff angereichertes Milieu für das Gewebe aufrechtzuerhalten.
- Identifizieren Sie den koronalen Hirnschnitt, der den Bereich von Interesse enthält. Richten Sie den Hirnschnitt mit einem Pinsel flach auf dem Boden der Petrischale aus. Wählen Sie den Gewebestanzer mit dem geeigneten Durchmesser gemäß Tabelle 1 oder anderen Referenzen aus. Halten Sie den koronalen Gewebeschnitt mit dem Pinsel an Ort und Stelle und senken Sie die Schneidspitze des Gewebestanzers auf die Oberfläche des Gewebeschnitts ab.
- Üben Sie Druck aus, indem Sie die Spitze des Gewebestanzers durch den Gewebeschnitt hindurch fest auf den Boden der Petrischale drücken. Führen Sie eine rollende kreisförmige Bewegung aus, um sicherzustellen, dass der Bereich von Interesse vom umgebenden Gewebe gelöst wurde. Heben Sie den Gewebestanzer vorsichtig vom Gewebeschnitt ab und lösen Sie den Mikrostanz, sodass dieser im EBSS schwimmt.
- Verwenden Sie einen Pinsel, um den Gewebemikrostanz unverzüglich in ein auf Trockeneis gehaltenes, für -80 °C geeignetes Lagertuben zu überführen. Das Gewebe sollte leicht an der Tubenwand haften. Stellen Sie die Tube mit der Mikroprobe zurück auf das Trockeneis.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2–3.4 für jeden interessierenden Hirnbereich.
4. Gewebearchivierung
- Wenn die Mikrodissektion abgeschlossen ist, verwenden Sie das VisionMate-Scannersystem, um die jeweiligen Barcodes für jeden TrakMates-Röhrchen mit Probe zu erfassen. Sobald das 96-Plätze-TrakMates-Röhrchenrack gefüllt ist, scannen Sie das Rack schnell und stellen Sie die Gewebeproben unverzüglich in einen -80 °C-Gefrierschrank bis zur RNA-Extraktion ein.
5. Gesamt-RNA-Extraktion
- Bereiten Sie einen RNase-freien Arbeitsplatz mit RNaseZap vor. Bereiten Sie eine ausreichende Menge an magnetischer Bead-Mischung und Lyselösung/Bindungslösung gemäß der Anleitung im MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol10 vor.
- Entnehmen Sie die Gewebeproben aus dem -80 °C-Gefrierschrank und stellen Sie die Röhrchen direkt auf Trockeneis.
- Geben Sie 100 μL der Lyselösung/Bindungslösung in ein TrakMates-Röhrchen, das eine Probe enthält. Befestigen Sie einen nukleasefreien, 0,5 ml-Röhrchen geeigneten Stößel am Pelletmischer und homogenisieren Sie das Gewebe. Überführen Sie die homogenisierte Probe mithilfe einer pipettenspitze mit niedriger Retention und nukleasefrei in eine Vertiefung einer runden 96-Well-Zellkulturplatte mit abgerundetem Boden. Geben Sie sofort 60 μL 100 % Isopropanol mit einer pipettenspitze mit niedriger Retention und nukleasefrei hinzu und mischen Sie durch 3–4-maliges Auf- und Abpipettieren.
- Geben Sie 20 μL der Bead-Mischung mit einer pipettenspitze mit niedriger Retention und nukleasefrei zur Probe hinzu. Mischen Sie durch 3–4-maliges Auf- und Abpipettieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.3–5.4 für alle Gewebeproben.
- Folgen Sie ab Schritt III.A.2 der Anleitung im MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol, um die Gesamt-RNA-Extraktion abzuschließen. HINWEIS: Andere kommerziell erhältliche Gesamt-RNA-Isolationskits mit magnetischen Beads sind verfügbar; diese wurden jedoch in der vorliegenden Studie nicht untersucht. Bitte beachten Sie die Herstelleranleitungen der jeweiligen Kits für die Durchführung der Gesamt-RNA-Isolierung mit den entsprechenden Produkten.
- Messen Sie Reinheit und Konzentration der gewonnenen Gesamt-RNA mit einem NanoDrop 3300-Spektrophotometer oder anderen Technologien für kleine Probenvolumina wie Spektrophotometern oder Fluorometern.
6. Repräsentative Ergebnisse:
| Hirnregion/Kern | Durchmesser des Gewebekerners (mm) | Gesamt-RNA (ng/μL) | 260/280-Verhältnis |
| Frontaler Kortex | 2,0 | 27,03 | 1,99 |
| Nucleus accumbens | 1,0 | 6,26 | 2,77 |
| Striatum | 1,5 | 27,94 | 2,19 |
| Cingulärer Kortex | 1,5 | 29,05 | 2,07 |
| Hypothalamus – Paraventrikulärer Kern / Suprachiasmatischer Kern (PVN/SCN) | 2,0 | 40,34 | 2,03 |
| Thalamus | 2,0 | 34,40 | 2,00 |
| Hypothalamus – dorsomedialer Kern / ventromedialer Kern (DMH/VMH) | 2,0 | 44,83 | 2,05 |
| Amygdala | 1,0 | 10,06 | 1,89 |
| Hippocampus – CA 2/3 | 1,5 | 7,31 | 2,32 |
| Hippocampus – CA1/Dentategyrus | 1,5 | 5,20 | 2,24 |
| Periaquäduktales Grau | 1,0 | 48,21 | 2,02 |
| Dorsaler Raphe-Kern | 1,0 | 6,56 | 2,18 |
| Reticuläre Formation | 2,0 | 35,35 | 2,27 |
Tabelle 1. Aufzählung mikrodissezierter Maushirnregionen mit jeweils optimalen Gewebekernbohrerdurchmessern, repräsentativer Gesamt-RNA-Ausbeute und Reinheit. Die 13 mikrodissezierten Hirnregionen, aufgelistet in rostrokaudaler Reihenfolge, variieren in Größe und Ausrichtung. Der PVN/SCN-Mikrostich beinhaltet den anteromedialen paraventrikulären Kern, Anteile des periventrikulären Kerns, die subparaventrikuläre Zone sowie andere parvozelluläre Neurone. Der Thalamus-Mikrostich umfasst die vorderen thalamischen Kerne, die sich in derselben koronaren Ebene wie die PVN/SCN-Mikrostichregion befinden. Der DMH/VMH-Mikrostich beinhaltet akzessorische magnozelluläre Kerne und andere parvozelluläre Neurone, die sich zwischen dem dorsomedialen und dem ventromedialen Kern befinden. Die Amygdala-Probe enthält sowohl die zentrale als auch die basolaterale Teilregion. Die RNA-Ausbeute und die 260/280-Verhältnisse sind Einzelwerte, die jeweils aus Mikrodissektionsproben gewonnen wurden, um die aus jeder Hirnregion erhaltenen Messwerte zu veranschaulichen.
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Diskussion
Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll, die sorgfältige Aufmerksamkeit und Überlegung erfordern. Die Auswahl des geeigneten Gewebecylinders (Tissue Corer) hinsichtlich des Durchmessers muss für die Entnahme jedes jeweiligen interessierenden Bereichs bestimmt werden. Obwohl die in Tabelle 1 angegebenen Durchmesser der Gewebecylinder für die Gewinnung der aufgeführten Hirnregionen geeignet sind, sollte jeder Forscher den für die optimale Gewinnung seines jeweiligen Zielgewebes passenden Durchmesser des Gewe...
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Offenlegungen
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) und dem Army Research Office (ARO) finanziert, Fördernummer W911NF-10-1-006.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Isotemp 102 Wasserbad | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| Laborrotator (Orbital-Shaker) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| Pelletmischer | VWR international | 47747-370 | |
| RNase-freie 0,5 mL Stößel | VWR international | KT749521-0590 | Nukleasefrei |
| Diethylpyrocarbonat (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| Doppelschneidige Rasierklingen | Stoelting Co. | 51427 | |
| St–lting Gewebeschneider mit manuellem Mikrometer | Stoelting Co. | 51425 | |
| 2/0 Runder Künstlerpinsel’ | Princeton Art Brush | 4350R | |
| Harris Uni-Core Gewebestanzer (0,75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Harris Uni-Core Gewebestanzer (1,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Harris Uni-Core Gewebestanzer (1,5 mm) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Harris Uni-Core Gewebestanzer (2,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| Giljotine | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| DecapiCones | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’s abgeglichene Salzlösung (EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| 25 mL Pipetten | Corning | 4489 | Nukleasefrei |
| epT.I.P.S. LoRetention Dualfilter-Pipettenspitzen, 20 — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| TrakMates Schraubverschlussröhrchen mit Deckeln | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| VisionMate kabelloser 2D-Barcodeleser | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| VisionMate SR Einzelständer 2D-Barcodeleser | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1–200 μL Universal-Pipettenspitzen | Corning | 4864 | Nukleasefrei |
| Cellstar Zellkulturschalen | Greiner Bio-One | 628160 | Nukleasefrei |
| Greiner Bio-One 96-Well Polystyrol Cellstar Zellkulturplatte, U-Boden | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | Nukleasefrei |
| #4 Filterpapier | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| Silikon-Ballpipettierhilfe | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| NanoDrop 3300 Spektrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Referenzen
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- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
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Nachdrucke und Genehmigungen
