Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Zusammenfassung

RNA-Expressionsprofilierung von diskreten Hirnregionen von Mäusen erfordert eine präzise und wiederholbare Gewebeentnahmestrategie. Ein Protokoll, das sowohl koronale Hirnschnitte als auch Gewebekern-assistierte Mikrodissektionen verwendet, wird hier beschrieben. Die Ausbeute und Qualität der Gesamt-RNA, die aus den resultierenden Proben gewonnen wird, bestätigt den Nutzen der beschriebenen Methode.

Zusammenfassung

Als technologische Plattformen sind Ansätze wie Next-Generation-Sequencing, Microarray und qRT-PCR vielversprechend, um unser Verständnis der Breite der molekularen Regulation zu erweitern. Neuere Ansätze wie die hochauflösende RNA-Sequenzierung (RNA-Seq)¹ liefern neue und umfassende Informationen über gewebe- oder zustandsspezifische Expression, wie z. B. relative Transkriptspiegel, alternatives Spleißen und Mikro-RNAs^2-4. Die Aussichten für die Anwendung der RNA-Seq-Methode bei der vergleichenden Erstellung von Gesamttranskriptomprofilen⁵ innerhalb diskreter Gewebe oder zwischen phänotypisch unterschiedlichen Gruppen von Individuen bieten neue Wege zur Aufklärung molekularer Mechanismen, die sowohl an normalen als auch an abnormalen physiologischen Zuständen beteiligt sind. Kürzlich wurde ein vollständiges Transkriptom-Profiling an menschlichem Hirngewebe durchgeführt, um Unterschiede in der Genexpression zu identifizieren, die mit dem Fortschreiten der Krankheit verbunden sind⁶. Der Einsatz von Next-Generation-Sequencing muss jedoch noch in größerem Umfang in Säugetierstudien integriert werden.

Genexpressionsstudien in Mausmodellen haben mit Hilfe der Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) zur Probenexzision unterschiedliche Profile innerhalb verschiedener Hirnkerne berichtet^7,8. Während LCM eine Probenentnahme mit Präzision für Einzelzellen und diskrete Hirnregionen ermöglicht, können die relativ geringen Gesamt-RNA-Ausbeuten des LCM-Ansatzes für RNA-Seq und andere Profiling-Ansätze in Hirngeweben von Mäusen unerschwinglich sein und suboptimale Probenamplifikationsschritte erfordern. Hier wird ein Protokoll für die Mikrodissektion und die Total-RNA-Extraktion aus diskreten Hirnregionen der Maus vorgestellt. Gewebecorer mit festgelegtem Durchmesser werden verwendet, um 13 Gewebe aus 750 μm großen seriellen Koronalesen eines einzelnen Mausgehirns zu isolieren. Gewebe-Micropunch-Proben werden sofort eingefroren und archiviert. Die Gesamt-RNA wird aus den Proben mit Hilfe der magnetischen Bead-fähigen Gesamt-RNA-Isolierungstechnologie gewonnen. Die resultierenden RNA-Proben weisen eine ausreichende Ausbeute und Qualität für die Verwendung in der nachgelagerten Expressionsprofilierung auf. Diese Mikrodissektionsstrategie bietet eine praktikable Option zu bestehenden Probenentnahmestrategien zur Gewinnung von Gesamt-RNA aus diskreten Hirnregionen und eröffnet Möglichkeiten für neue Entdeckungen der Genexpression.

Protokoll

1. Einrichtung und Vorbereitung der Probenahme

1. Ergänzen Sie die Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) mit Natriumbicarbonat (0,44 g pro 100 mL EBSS) und Glukose (0,884 g pro 100 mL EBSS)⁹. Behandeln Sie das EBSS mindestens 12 Stunden lang bei 37 °C in einer autoklavierbaren Flasche oder einem Kolben mit Schraubverschluss mit DEPC (0,1 mL pro 100 mL EBSS).
2. Legen Sie 5 3/4" Glaspasteurpipetten in ein 1000-ml-Glasbecherglas und platzieren Sie Künstlerpinsel mit den Borsten nach oben in einen 100-ml-Messzylinder aus Glas. Fügen Sie ausreichend DEPC-Lösung (0,1 mL pro 100 mL ddH₂O) hinzu, um die Pipetten bzw. Bürsten zu bedecken. Das Becherglas und der Messzylinder werden mit Alufolie abgedeckt und mindestens 12 Stunden bei 37 °C inkubiert.
3. Nach einer 12-stündigen Inkubation mit DEPC werden alle mit DEPC behandelten Materialien mindestens 15 Minuten lang auf eine Temperatur >100 °C erhitzt. EBSS entfernen und vor der Lagerung bei 4 °C auf Raumtemperatur abkühlen. ddH₂O aus dem Becherglas und dem Messzylinder abgießen; Bei >100 °C weiter inkubieren, bis das Material trocken ist. Herausnehmen, auf Raumtemperatur abkühlen lassen und für die spätere Verwendung aufbewahren.
4. Behandeln Sie am Tag des Experiments alle Arbeitsflächen mit RNaseZap.
5. Legen und pflegen Sie das EBSS in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 40 °C. Um das EBSS zu puffern und mit Sauerstoff zu versorgen, infiltrieren Sie mit 95 %/5 % O₂/CO₂, indem Sie einen Gasschlauch in eine RNase-freie Pasteurpipette stecken und die Pipette in das EBSS einführen. Decken Sie die Öffnung des EBSS-Behälters ab.
6. Richten Sie einen Stoelting-Gewebeschneider für die serielle Schnittung des Hirngewebes ein. Behandeln Sie die Ober- und Unterseite des Tissue Slicers mit RNaseZap. Befestigen Sie ein rechteckiges Stück Whatman #4 Filterpapier an der Plexiglasoberfläche des Taschentuchzerkleinerers. Befestigen Sie eine zweischneidige Rasierklinge am Hackerarm. Stellen Sie das Mikrometer auf Null und stellen Sie die Mindesthöhe des Zerkleinerarms so ein, dass die Rasierklinge das Filterpapier, aber nicht die Plexiglasplatte durchtrennen kann.
7. Sammeln Sie alle zusätzlichen Materialien, die für die Mikrodissektion benötigt werden, einschließlich RNase-freier 60x15 mm Zellkulturschalen, Harris Uni-Core Gewebecorer, 200 μl RNase-freie Mikropipettenspitzen zum Anbringen an Gasschläuchen für die EBSS-Sauerstoffversorgung von koronalen Hirnschnitten während des Stanzens von Mikroproben, gebogene Scheren, Trockeneis und Röhrchen für die Gewebeentnahme. Legen Sie die Röhren auf Trockeneis.

2. Entnahme des Gehirns und koronale Schnitte

1. Setze die Maus in einen Dekapikegel und enthaupte sie mit einer Nagetier-Guillotine. Den Kopf aus dem DecapiCone nehmen und auf eine ebene Fläche legen. Schneiden Sie mit einem Skalpell die Haut entlang der Mittellinie des Schädels, beginnend etwa 3 mm kaudal bis zum Nasenloch. Ziehen Sie die Hautlappen seitlich zurück, um den Schädel und die Augenhöhlen freizulegen.
2. Schneiden Sie mit einer gebogenen Schere beide Sehnerven durch und trennen Sie ihre Verbindung zum Auge. Öffnen Sie die Schädelhöhle, indem Sie vorsichtig die Hinterhaupt- und Interparietalknochen brechen und die dorsalen Scheitel- und Stirnknochen entfernen. Brechen Sie mit einem Knochenrongeur die Nasen- und Tränenknochen, um die Riechkolben freizulegen. Schneide mit einer gebogenen Schere die Riechkolben vom rostralen Gehirn weg. Entfernen Sie das gesamte Gehirn mit intaktem Hinterhirn. Legen Sie das Gehirn in eine 60 x 15 mm große, RNase-freie Cellstar-Zellkulturschale. Auf die Arbeitsfläche der Gewebeentnahme übertragen.
3. Verwenden Sie eine RNase-freie Pipette, um das Filterpapier konservativ mit EBSS auf den beigefügten Gewebezerkleinerer zu befeuchten. Befeuchten Sie das Hirngewebe mit EBSS.
4. Übertragen Sie das Gehirn in den Gewebehacker und richten Sie die entsprechende Ausrichtung ein. Hinweis: Das Gehirn sollte so positioniert werden, dass die Bauchfläche auf dem Filterpapier aufliegt. Die Mittellinie (interhemisphärische Fissur) sollte senkrecht zur Chopperklinge verlaufen, und der rostrale Rand des Gehirns sollte an die Klinge anstoßen.
5. Verwenden Sie einen DEPC-behandelten Künstlerpinsel, um das Gehirn durch sanften Druck auf die dorsale Oberfläche des Gehirns stationär zu halten. Während Sie das Gehirn stationär halten, heben Sie den Hebel des Klingenhalters ca. 4-5 cm über die dorsale Gewebeoberfläche und halten Sie ihn in dieser Position. Entfernen Sie den Pinsel von der Gehirnoberfläche und stellen Sie mit dem Mikrometer 750 μm ein. Lassen Sie den Hebel fallen, hacken Sie das Gewebe und erstellen Sie einen 750 μm großen Koronalschnitt.
6. Während das Häckselmesser stationär bleibt, wischen Sie mit dem Künstlerpinsel mit einer rollenden Bewegung den Gewebeabschnitt vorsichtig von der Klingenoberfläche weg. Legen Sie den Gewebeschnitt sofort in das sauerstoffhaltige EBSS in der Petrischale. Ein zweiter Prüfer kann mit Schritt 3.1 beginnen.
7. Die Schritte 2.5 und 2.6 werden so lange wiederholt, bis serielle Hirnschnitte über die gesamte rostro-kaudale Ebene erhalten wurden.

3. Mikrodissektion der Hirnregion

1. Passen Sie die Beleuchtung so an, dass die Probenbeleuchtung während der Gewebemikrodissektion nicht behindert wird. Passen Sie die Position und den Fluss der 95%/5%-Mischung aus O₂/CO₂ an, um während der Mikrodissektion eine gepufferte, sauerstoffreiche Umgebung für das Gewebe zu erhalten.
2. Identifizieren Sie den koronalen Hirnabschnitt, der die interessierende Region umfasst. Richten Sie den Gehirnabschnitt mit einem Künstlerpinsel flach auf der Unterseite der Petrischale aus. Wählen Sie den Gewebecorer mit dem entsprechenden Durchmesser auf der Grundlage von Tabelle 1 oder anderen Referenzen aus. Während Sie den koronalen Gewebeschnitt mit dem Künstlerpinsel an Ort und Stelle halten, führen Sie die Schneidspitze des Gewebecorers über die Oberfläche des Gewebeschnitts nach unten.
3. Drücken Sie unter Druck die Spitze des Gewebeentkerners durch den Gewebeabschnitt und fest auf den Boden der Petrischale. Verwenden Sie eine rollende kreisende Bewegung, um sicherzustellen, dass die interessierende Region vom umgebenden Gewebe getrennt wurde. Heben Sie den Gewebecorer vorsichtig vom Gewebeschnitt weg und lösen Sie den Mikrostanzer, damit er im EBSS schwimmen kann.
4. Den Gewebe-Micropunch sofort mit einem Künstlerpinsel in ein -80 °C stabiles Aufbewahrungsröhrchen geben, das auf Trockeneis aufbewahrt wird. Das Gewebe sollte leicht an der Seite des Schlauchs haften. Setzen Sie das Röhrchen mit der Mikroprobe wieder in das Trockeneis ein.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 - 3.4 für jede interessierende Gehirnregion.

4. Archivierung von Gewebe

1. Sobald die Mikrodissektion abgeschlossen ist, verwenden Sie das VisionMate-Scannersystem, um die entsprechenden Barcodes für jedes probenhaltige TrakMates-Röhrchen aufzuzeichnen. Sobald das TrakMates Röhrchengestell mit 96 Schlitzen befüllt ist, scannen Sie das Gestell schnell und legen Sie die Gewebeproben sofort bis zur RNA-Extraktion in einen -80 °C heißen Gefrierschrank
.

5. Gesamt-RNA-Extraktion

1. Bereiten Sie einen RNase-freien Arbeitsbereich mit RNaseZap vor. Bereiten Sie eine ausreichende Menge an magnetischer Bead-Mischung und Lyse-/Bindungslösung vor, wie im MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol¹⁰ beschrieben.
2. Entnehmen Sie Gewebeproben aus dem -80 °C Gefrierschrank und legen Sie die Röhrchen direkt auf Trockeneis.
3. Geben Sie 100 μl der Lyse-/Bindungslösung in ein probenhaltiges TrakMates-Röhrchen. Setzen Sie einen nukleasefreien 0,5-ml-Stößel in Röhrchengröße auf den Pelletmischer und homogenisieren Sie das Gewebe. Übertragen Sie die homogenisierte Probe mit einer nukleasefreien Pipettenspitze mit geringer Retention in eine Vertiefung auf einer 96-Well-Gewebekulturplatte mit rundem Boden. Geben Sie sofort 60 μl 100 % Isopropanol mit einer nukleasefreien Pipettenspitze mit geringer Retention in die Probe und mischen Sie, indem Sie 3-4 Mal auf und ab pipettieren.
4. Geben Sie 20 μl des Bead Mix mit einer nukleasefreien Pipettenspitze mit geringer Retention in die Probe. Mischen, indem Sie 3-4 Mal auf und ab pipetten.
5. Wiederholen Sie die Schritte 5.3-5.4 für alle Gewebeproben.
6. Befolgen Sie die Schritte des MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol ab III.A.2, um die Gesamt-RNA-Extraktion abzuschließen. Anmerkung: Andere magnetische Bead-fähige Gesamt-RNA-Isolationskits sind im Handel erhältlich. Sie wurden in dieser Studie jedoch nicht untersucht. Einzelheiten zur vollständigen RNA-Isolierung mit den jeweiligen Produkten finden Sie in den Kit-Handbüchern des Herstellers.
7. Messen Sie die Reinheit und Konzentration der resultierenden Gesamt-RNA mit einem NanoDrop 3300 Spektralphotometer oder anderen Spektralphotometer-/Fluorometertechnologien für kleine Volumina.

6. Repräsentative Ergebnisse:

kg Uhr kg kg kg kg kg kg kg kg Uhr kg kg kg kg kg kg Uhr kg kg kg kg Uhr kg kg Uhr kg kg Uhr kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

Hirnregion/Zellkern	Durchmesser des Gewebeentkerners (mm)	Gesamt-RNA (ng/μL)	260/280 Verhältnis
Frontaler Kortex	2,0	27.03	1,99
Nucleus accumbens	1,0	6,26	2,77
Striatum	1,5	27,94	2,19
Cingulate Cortex	1,5	29.05	2,07
Hypothalamus - Nucleus paraventricularis / Nucleus suprachiasmaticus (PVN/SCN)	2,0	40,34	2,03
Thalamus	2,0	34,40	2,00
Hypothalamus - Dorsomedialer Kern / Ventromedialer Kern (DMH/VMH)	2,0	44,83	2,05
Amygdala	1,0	10.06	1,89
Hippocampus - Ca 2/3	1,5	7.31	2,32
Hippocampus - Ca1/Gyrus dentatus	1,5	5,20	2,24
Periaquäduktal Grau	1,0	48,21	2,02
Dorsaler Raphe-Kern	1,0	6,56	2,18
Retikuläre Formation	2,0	35,35	2,27

Tabelle 1. Zählung von mikrodisparierten Hirnregionen von Mäusen mit jeweils optimalen Gewebecorer-Durchmessern, repräsentativer Gesamt-RNA-Ausbeute und Reinheit. Die 13 mikropräparierten Hirnregionen, die in rostro-kaudaler Reihenfolge aufgeführt sind, variieren in Größe und Ausrichtung. Der PVN/SCN-Mikropunch umfasst den anteromedialen paraventrikulären Kern, Teile des periventrikulären Kerns, die subparaventrikuläre Zone und andere parvozelluläre Neuronen. Der Thalamus-Mikrostempel umfasst anteriore Thalamuskerne, die sich in der gleichen koronalen Ebene wie die PVN/SCN-Mikrostanzregion befinden. Der DMH/VMH-Mikrostempel umfasst akzessorische magnozelluläre Kerne und andere parvozelluläre Neuronen, die sich zwischen dem dorsomedialen Kern und dem ventromedialen Kern befinden. Die Amygdala-Stichprobe umfasst sowohl die zentralen als auch die basolateralen Subregionen. Die RNA-Ausbeute und das Verhältnis 260/280 sind Einzelwerte, die aus den jeweiligen Mikrodissektionsproben gewonnen wurden, um die Messwerte aus jeder Gehirnregion zu demonstrieren.

Diskussion

Es gibt viele kritische Schritte in diesem Protokoll, die sorgfältige Aufmerksamkeit und Überlegung erfordern. Die Auswahl des geeigneten Tissue-Corer-Durchmessers muss bestimmt werden, um die jeweilige Region of Interest zu entfernen. Während die in Tabelle 1 dargestellten Gewebecorerdurchmesser für die Entnahme der aufgelisteten Hirnregionen geeignet sind, sollte jeder Untersucher den entsprechend großen Gewebecorer für eine optimale Entnahme seiner jeweiligen Gewebe von Interesse bestimmen. Zweitens wurde experimen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Isotemp 102 Wasserbad	Fisher Scientific	15-460-3Q
RNase Zap	Ambion	AM9782
Laborrotator (Orbitalschüttler)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314 –- 1CEQ
Pelletmischer	VWR international	47747-370
RNasefreier 0,5 mL Stößel	VWR international	KT749521-0590	Nukleasefreies
Diethylpyrocarbonat (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758-50ML
Doppelschneidige Rasierklingen	Stoelting Co.	51427
St– Tissue-Slicer mit manueller Messschraube	Stoelting Co.	51425
2/0 Runder Künstler' s Bürste	Princeton Art Brush	4350R
Harris Uni-Core Entkerner (0.75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Harris Uni-Core Entkerner (1,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15099
Harris Uni-Core Entkerner (1,5 mm)	Ted Pella, Inc.	15075
Harris Uni-Core Entkerner (2,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15076
Guillotine	Braintree Scientific, Inc.	RG-100
DecapiCones	Braintree Scientific, Inc.	MDC-200
HyClone Earle' s ausgewogene Salzlösung (EBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30029.02
25 mL Pipetten	Corning	4489	Nukleasefreies
epT.I.P.S. LoRetention Dualfilter-Pipettenspitzen, 20 – 300 μ L	Eppendorf	0030 077.636
TrakMates Schraubverschlussrohre mit Verschlüssen	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3741
VisionMate drahtloses 2D-Barcode-Lesegerät	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3122MTX
VisionMate SR 2D-Barcodeleser mit einem Rack	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3115
1-200 μ L Universal Fit Pipettenspitzen	Corning	4864	Nukleasefreie
Cellstar Zellkulturschalen	Greiner Bio-One	628160	Nukleasefrei
Greiner Bio-One 96-Well Polystyrol Cellstar Gewebekulturplatte, U-Boden	USA Scientific, Inc.	5665-0180	Nukleasefrei
#4 Filterpapier	Whatman, GE Healthcare	1004 150
Sicherheitspipettenfüller mit Silikonkolben	Fisher Scientific	13-681-102A
NanoDrop 3300 Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-3300