CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Protokoll

1. Bereiten mikrofluidischen Kanal mit anti-CD4 ⁺ biotinlayted Oberfläche.
2. Injektion von 10 ml Probe Blut bei 5 ml / min in den mikrofluidischen Kanal mit Spritzenpumpe.
3. Spülen Sie das Blut bei 20 ml / min für 20 min mit PBS.
4. Inject verdünnt FACS Lyse-Lösung (verdünnt auf 10% von Stammlösung mit PBS) bei 5ul/min für 15 min.
5. Inkubation: 15 min.
6. Inject primären CD3 ^{+-Antikörper-Lösung} (verdünnt auf 10% von Stammlösung mit PBS) bei 5 ml / min für 20 min.
7. Inkubieren für 2 Stunden.
8. Spülen Sie Kanal mit PBS auf 5 ml / min für 15 min.
9. Inject 20% AF488 CD4 ^{+-Antikörper,} 0,2% DAPI-Stammlösung und 10% sekundäre CD3 ⁺ Antikörper bei 5 ml / min für 20 min zur gleichen Zeit.
10. Inkubieren für 20 min.
11. Spülen Sie den Kanal mit PBS auf 5 ml / min für 15 min.
12. Zählen von Zellen unter Fluoreszenzmikroskop:
    1. White (optisch) - Schwarz und Weiß: Zell-und Staub
    2. UV (DAPI) - Blue: Zelle nur
    3. Blue (CD4 ⁺⁾ - Grün: T-Lymphozyten und Monozyten
    4. Green (CD3 ⁺⁾ - Rot: T-Lymphozyten nur

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PDMS-Mikrokanal				Herstellung mittels SU-8-Form
Blut				Gespendetes Blut von gesunden menschlichen Probanden. Mass General Hospital, 10× hohe Leukozytenkonzentration oder Brigham and Women’s Hospital.
PBS	Puffer	Invitrogen	14190	1× Dulbecco’s phosphatgepufferter Salzlösung.
FACS-Lyselösung		BD Biosciences	349202	Mit PBS auf 10 % der Stammlösung verdünnt.
Anti-CD4+-Antikörper, biotinyliert		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Oberfläche beschichtet mit biotinyliertem Anti-CD4+-Antikörper, nach Zugabe von 0,2 mg Stammlösung und 1 ml deionisiertem Wasser mit PBS/BSA auf 10 % verdünnt.
goat anti-hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Mit PBS auf 10 % der Stammlösung verdünnt
Kaninchen-anti-Ziege-IgG-PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Sekundärantikörper für anti-CD3-Antikörper, mit PBS auf 10 % der Stammlösung verdünnt
anti-menschlicher CD4+		BD Biosciences	557695	Mit Alexa Fluor 488 markiert, mit PBS auf 20 % der Stammlösung verdünnt.
DAPI		Invitrogen	D1306	4’,6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochloridlösung, mit PBS auf 0,2 % der Stammlösung verdünnt.