NIH3T3-Zellen der Zubereitung:
A. Zellen für Ejection
- Trypsinize Zellen, dann verdünnt 1:1 mit Zell-Medien und Übertragung von einem T75 Kolben in ein 15 ml Falcon-Röhrchen
- Spin down-Zellen zu einem Pellet durch Zentrifugation, Absaugen des Überstandes und waschen Sie die Zellen mit DPBS
- Spin down-Zellen zu einem Pellet erneut, und saugen Überstand
- Die Zellen in den Medien
- Bestimmen Sie die Zelldichte mit Zählkammer (~ 200 X 10 4 Zellen / ml pro Flasche T75)
- Zentrifugenzelle Lösung absaugen Überstand und resuspendieren in entsprechender Höhe von Medien für unterschiedliche Zell-Konzentrationen
B. Zell-Ausstoß
- Vortex-Zellen, bevor Sie zum Auswerfen
- Transfer-200 ul der Zell-Lösung in die Spritze
- Festlegen geeigneter Modus Impulsgeber
- Zum Auswerfen einzelner Tropfen und mehrere Tröpfchen (Bursts), setzen Impulsgeber zu "E. BUR"-Modus
- Für die kontinuierliche Tröpfchenausstoß setzen Impulsgeber auf "NORM"-Modus
- Ändern Signal-Einstellungen
- Set hohen und niedrigen Ausgangsspannung: HIL bis 5 V und LOL auf 0 V und sicherstellen, dass die "LIM" LED ist an
- Set-Signal als Rechteckimpuls
- Ändern Sie die Höhe der Zeit das Magnetventil ist offen für Tröpfchenausstoß indem Sie den Wert für "WID" oder Ändern Einschaltdauer ("Pflicht")
- Ändern Sie die Frequenz eines Rückschlags indem Sie den Wert für "PRO"
- Ändern Sie die Anzahl der Tropfen in einem Ausbruch, indem der Wert für "BUR" ausgeworfen
- Eject Zelle Lösung auf den vorbereiteten Untergrund für die Bildgebung mit Mikroskop
C. Färbung
- Make up Farbstofflösung mit 0,5 ul Calcein-AM und 2 ul Ethidium Homodimer pro ml DPBS
- Tauchen vorbereiteten Untergrund in Farbstofflösung
- Lassen Sie Probe für 10 Minuten bei 37 ° C inkubieren, bevor Bildgebung
Experiment Validation
- Auf einem Nikon Eclipse TE-2000 U Fluoreszenzmikroskop
- Spot fortschrittliche Software (Diagnostics, Inc.)
- Live / Dead Assay
