Eine Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie-Technik zur Untersuchung der Selbstorganisation von Peptiden

Zusammenfassung

Quelle: Neves, R., et al. Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolan-modifizierten selbstorganisierenden Peptiden. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert die Selbstorganisation von Amyloid-Peptiden zu einer Beta-Faltblatt-reichen supramolekularen Struktur mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie. Ein Infrarotstrahl wird durch einen Kristall mit hohem Brechungsindex geleitet, und die Energieabsorption über die Grenzfläche des Kristalls und der Probe wird aufgezeichnet. Die Sekundärstrukturen der Probenproteine werden durch die Analyse ihrer charakteristischen Absorptionsspitzen in bestimmten Bereichen des Infrarotspektrums identifiziert, was bei der Identifizierung der Bildung der supramolekularen Anordnung hilft.

Protokoll

1. Charakterisierung supramolekularer Selbstorganisationsstrukturen

1. Bildung von Amyloidfasern
   1. Um eine Selbstorganisationslösung herzustellen, wiegen Sie 1 mg des Peptidpulvers mit einer Analysenwaage ab. In einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in einem Gemisch (pH 7,5) aus 20 % Acetonitril und 10 mM (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES) auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml Peptidanordnungsgemisch auflösen. Wirbeln Sie die Montagelösung vor und lassen Sie sie bei Raumtemperatur zusammenbauen.
2. Spektroskopische Charakterisierung von Amyloidfasern
   1. Verfolgen Sie den Peptidassemblierungsprozess alle paar Tage mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR). Ein breiter Peak, der um 1670 cm-1 zentriert ist, ist die ^IR-Signatur, die von unassemblierten Peptiden in der Probe stammt. Bei den Peptidassemblierungsproben dauert es in der Regel ein bis zwei Wochen, bis der breite, nicht assemblierte Peak verschwindet und die Reifung erreicht.
      1. Ein Aliquot von 8-10 μl der Assemblierungslösung wird als dünner Film auf dem ATR-Diamantkristall getrocknet. Beobachte das Verschwinden einer großen und breiten Wasserspitze von 1640 bis 1630 ^cm-1, während sich der Trockenfilm bildet.
      2. Erfassen Sie IR-Spektren von 1500 bis 1800 ^cm-1 mit durchschnittlich 50 Scans mit einer Auflösung von 2 ^cm-1. Erfassen und subtrahieren Sie die Hintergrundscans vor jedem Sample-Scan. Die IR-Signatur für die β-Blatt-Montage ist eine scharfe Spitze zwischen 1625 und 1635 ^cm-1 (Abbildung 1A).

Ergebnisse

Abbildung 1. Supramolekulare Charakterisierung von 1,2-Dithiolan-modifiziertem Peptid. (A) FT-IR von 1 mg/ml 1,2-Dithiolan-KLVFFAQ-NH_2-Fasern, montiert in 10 mM HEPES, pH 7,5 in 20 % CH₃CN. Der Peak bei 1627 ^cm-1 stimmt mit den...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acetonitril	Fisher Scientific	A998-4	Entzündlich; reizt die Augen; Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung; Nur unter einem Abzug verwenden; von offener Flamme oder heißer Oberfläche fernhalten; Bei Kontakt mindestens 15 Minuten mit Wasser spülen und ärztlichen Rat aufsuchen
4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure	Acros Organics	AC172571000	Nicht einatmen; im Freien oder in gut belüfteten Räumen verwenden
Fourier-Transform-Infrarot-Spektrometer	Alpha-Tensor, Bruker