Performing Benutzerdefinierte MicroRNA Microarray-Experimenten

Summary

Ein einfaches Verfahren zur Durchführung benutzerdefinierte microRNA Microarray-Experimenten beschrieben. Die Schritte umfassen Isolierung von RNA, die Kennzeichnung RNA und DNA-, Hybridisierung der Proben auf Microarrays, Scannen der Microarrays, Quantifizierung und Analyse Hybridisierungssignale.

Abstract

microRNAs (miRNAs) sind eine große Familie von ~ 22 Nukleotiden (nt) lange RNA-Moleküle, die weit in Eukaryoten ¹ sind ausgedrückt. Komplexer Genome kodieren mindestens Hunderte von miRNAs, die in erster Linie hemmt die Expression einer Vielzahl von Zielgenen posttranskriptional ^{2, 3.} miRNAs Steuerung einer breiten Palette von biologischen Prozessen ^1. Darüber hinaus hat sich verändert miRNA-Expression mit menschlichen Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht worden, und miRNAs können als Biomarker für Krankheiten und die Prognose ^{4, 5} dienen. Es ist daher wichtig, um die Expression und Funktion von miRNAs unter vielen verschiedenen Bedingungen zu verstehen.

Real-time PCR, Microarray und deep sequencing: Drei große Ansätze zum Profil miRNA-Expression eingesetzt. Die Technik der miRNA-Microarray hat den Vorteil, dass High-Throughput, in der Regel weniger teuer, und die meisten der experimentellen und Analyseschritte können carr werdenin einem molekularbiologischen Labor an den meisten Universitäten, medizinischen Fakultäten und die damit verbundenen Krankenhäusern IED. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Durchführung benutzerdefinierte miRNA Microarray-Experimenten. Ein miRNA-Sonde gesetzt werden auf Glasträger gedruckt werden, um miRNA-Mikroarrays herzustellen. RNA isoliert mit einer Methode oder Reagenz, dass kleine RNA-Spezies konserviert und anschließend mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Als Kontrolle werden Referenz-DNA-Oligonukleotide entsprechend einer Untergruppe von miRNAs auch mit einer anderen Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Die Referenz-DNA wird dazu dienen, die Qualität der Folie und Hybridisierung zu demonstrieren und auch für Daten Normalisierung verwendet werden. Die RNA und DNA werden gemischt und hybridisierte mit einer Microarray-Folie mit Sonden für die meisten der miRNAs in der Datenbank. Nach dem Waschen wird die Folie gescannt, um Bilder zu erhalten, und Intensitäten der einzelnen Spots quantifiziert. Diese Roh-Signale werden weiter verarbeitet und analysiert werden, wie der Ausdruck von Daten der entsprechenden miRNAs. MicroArray Folien können entfernt und regeneriert werden, um die Kosten von Microarrays zu reduzieren und die Konsistenz der Microarray-Experimente zu verbessern. Die gleichen Grundsätze und Verfahren sind für andere Arten von benutzerdefinierten Microarray-Experimenten.

Protocol

1. Drucken von benutzerdefinierten miRNA-Mikroarrays

1. Drucken Sie die Microarray-Slides mit Hilfe der Microarray-core facility services an einer Universität oder eines Unternehmens. Die Qualität der Microarray-Herstellung ist einer der wichtigsten Faktoren für den Erfolg eines Mikroarray-Experiment. Probieren Sie ein paar Dienste, wenn möglich. Idealerweise würde man 50-100 Dias zu einem Zeitpunkt, zu drucken und alle Folien werden identisch aussehen, mit gut voneinander getrennt, die einzelnen Spots.
2. Für Microarray-Unterstützung, verwenden wir die GAPS II beschichtete Objektträger.
3. Für miRNA Sonden, verwenden wir die NCode Multi-Species....

Discussion

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Deep-Sequencing-Technologien, bleibt Microarray eine gute Wahl für High-Throughput-Analyse von DNA und RNA. Im Vergleich zum tiefen Sequenzierung sind Microarray-Experimenten billiger, und ein typischer Molekularbiologie-Labor können die meisten der Experimente und Datenanalyse in-Haus, das für Flexibilität erlaubt und spart Zeit durchzuführen. In der Zukunft, Microarrays wahrscheinlich gut geeignet, um intensiv zu befragen Gruppen von Genen, z. B. sind, können alle oder eine Teilm.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Items	Verkäufer	Katalog-Nummer	Kommentare
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Entwickelt auf Basis der miRBase Release 9.0 (Oktober 2006). Es enthält ~ 1.140 unverändert, 34-44 nt lange Oligonukleotide als Sonden für Wurm, Fliege, Zebrafisch, Maus, Ratte und Mensch miRNAs, und eine Reihe von internen Kontroll-Sonden wie snoRNAs. Die miRNA-Sonden werden Dubletten der Sequenzen komplementär zu reifen miRNAs, damit die Größe ~ 44 nt. Für die Analyse kann man auf miRNAs aus einer bestimmten Erbgut (s) von Interesse zu konzentrieren.
Trizol	Invitrogen	15596018	Wir haben auch bereichert, kleine RNA-Fraktion für die Kennzeichnung, obwohl der Gesamt-RNA-Proben schneller und einfacher zu erstellen und zu quantifizieren und für nachgelagerte Anwendungen wie mRNA-Analyse sind.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	Dieses Kit oder ähnliche Produkte können verwendet werden, um experimentelle RNA-Proben oder ein Kontroll-RNA (anstelle von Kontroll-DNA) sowie Label werden.
5'-PCU-DY547-3 '	Dharmacon	Custom made	Kleine RNA-Fraktion kann in ähnlicher Weise durch Ligation bezeichnet werden.
Centrisep Spalten	Princeton Separations	CS-901
GAPSII beschichteten Objektträger	Corning	40004	Andere Arten von Folien können ebenfalls verwendet werden.
Microarray-Hybridisierung Kammern	Corning	2551 oder 40080	Andere Arten von Hybridisierung Kammern und Deckgläser sollten auch funktionieren. Mit kommerziell erhältlichen Hybridisierung Maschinen können Hybridisierung Zeit deutlich zu reduzieren, zB nach ~ 2 Stunden.
LifterSlips	ThErmo / Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent