Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Zusammenfassung

Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von ausgedehnten bakteriellen Co-Kultur mit EpiAirways, primären humanen respiratorischen Epithel an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche gewachsen, einem biologisch relevanten In-vitro- Modell. Der Ansatz kann mit jeder Mikrobe, die zugänglich für langfristige Zusammenarbeit Kultur verwendet werden.

Zusammenfassung

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) sind Menschen angepassten Gram-negative Bakterien, die wiederkehrende und chronische Infektionen der Schleimhaut der Atemwege ¹ Ursache ^{kann; 2.} Um die Mechanismen, mit denen diese Organismen an und im respiratorischen Gewebe überleben, ein Modell, in dem langfristig erfolgreiche Co-Kultur von Bakterien und menschlichen Zellen durchgeführt wird, gefordert werden kann, zu studieren. Wir verwenden primären humanen respiratorischen Epithelzellen Gewebe angehoben, um die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, die EpiAirway Modell (MatTek, Ashland, MA). Diese sind nicht unsterblich, gut differenzierten, 3-dimensionale Gewebe, die Tight Junctions, Flimmer-und nonciliated Zellen, Becherzellen, dass Mucin zu produzieren, und behalten die Fähigkeit, Zytokine in Reaktion auf eine Infektion zu erzeugen enthalten.

Diese biologisch relevanten In-vitro-Modell des menschlichen oberen Atemwege kann in einer Reihe von Arten verwendet werden; das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, langfristige Zusammenarbeit Kultur EpiAirway Gewebe mit NTHi und zu quantifizieren zellassoziierte und verinnerlicht Bakterien im Laufe der Zeit durchführen . Wie gut, kann Mucin Produktion und die Zytokin-Profil der infizierten Co-Kulturen bestimmt werden. Dieser Ansatz verbessert existierende Verfahren in, dass viele aktuelle Protokolle verwenden untergetaucht Mono-oder Transwell Kulturen von menschlichen Zellen, die nicht fähig sind, unterstützen bakterielle Infektionen über längere Perioden ^3. Zum Beispiel, wenn ein Organismus in der darüber liegenden Medien replizieren kann, kann dies zu nicht akzeptablen Niveau der Zytotoxizität und der Verlust der Wirtszellen durch, verhaftete das Experiment. Die EpiAirway Modell ermöglicht die Charakterisierung der langfristigen Wirt-Pathogen-Interaktionen. Ferner kann, da die Quelle für die EpiAirway ist normale menschliche tracheobronchialen Zellen anstatt einer immortalisierten Linie ist jeder eine ausgezeichnete Darstellung der tatsächlichen menschlichen oberen Atemwege Gewebe, sowohl in Struktur und in Funktion ^4.

Bei dieser Methode werden die EpiAirway Gewebe entwöhnt von anti-mikrobiellen und Anti-Pilz-Verbindungen für 2 Tage vor der Auslieferung, und alle Verfahren sind unter Antibiotika-freien Bedingungen durchgeführt. Dies erfordert besondere Überlegungen, da beide Bakterien und primären humanen Geweben in der gleichen Biosicherheitswerkbank verwendet werden und sind Co-Kultivierung über einen längeren Zeitraum.

Protokoll

1. Vorbereiten des Biosicherheitswerkbank für die EpiAirway Gewebe

1. Das Tragen eines speziellen Laborkittel, mit Haar zurück und Handschuhen verbunden, starten Sie den laminaren Strömung. Nach 5 Minuten, verschieben Sie alle Werkzeuge im Schrank (Pipetten, Spitzen, Reaktionsgefäße usw.) auf der einen Seite, sprühen die Biosicherheit Schrankinneren und Flügel mit 70% Ethanol und wischen Sie mit sauberen Papiertüchern. Spray die gereinigte Innenraum wieder mit 70% Ethanol und trocknen lassen. Bewegen Sie die Werkzeuge, um auf der sauberen Seite und wiederholen Sie den Vorgang Ethanol.
2. Verwenden Sie Aerosolbarriere Pipettenspitzen und engagierten Pip....

Diskussion

Diese Methode erlaubt die Untersuchung der langfristigen Wirt-Pathogen-Interaktionen in einem biologisch relevanten Hintergrund von primären humanen respiratorischen Gewebe an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Hier haben wir NTHi als der Erreger verwendet, sondern das Zusammenspiel von Bakterien, die nicht vorstellen unannehmbar Zytotoxizität im Laufe der Zeit kann mit dieser Methode quantifiziert werden. Die EpiAirway Modell kann auch für das Studium von Viren, Medikamente oder Chemikalien, die Auswirkungen des menschl.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz	Firma	Katalog #	Kommentare
Saponin	Calbiochem	558255-25g	1% in D-PBS ohne Calcium oder Magnesium-, Filter-sterilisiert
1 X Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium	Lonza	17-513Q
1 X Dulbeccos Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne Calcium oder Magnesium	Lonza	17-515Q
EpiAirway Antibiotika-freien Geweben	MatTek	AIR-100-ABF
EpiAirway Antibiotika-freien Medien Wartung	MatTek	AIR-100-MM-ABF	Geliefert mit kit
10X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung	EMD	6506	Verdünnen auf 1X vor Gebrauch
Gelatine	JT Baker	2124-01	Hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,1% in 1 X PBS und Autoklaven
Difco GC Medium Base (Schokolade-Agar)	VWR	90002-016	Autoclave 36 g in 500 ml ddH 2 O und kühl bis 60 ° C
BBL Hämoglobin (Schokolade-Agar)	VWR	90000-662	Autoclave 10 g in 500 ml ddH 2 O, kühl bis 60 ° C und vermischen sich mit der GC Basisnährboden oben
BD BBL IsoVitaleX Anreicherung (Schokolade-Agar)	VWR	90000-414	Das Gemisch von GC Basisnährboden und Hämoglobin bis 55 ° C und 10 ml rehydratisiert IsoVitaleX, pour Schokolade-Agar-Platten
Anatomische Pinzette, feine Spitze, gebogene	VWR	82027-406
Self-Abdichtung Sterilisation Beutel	VWR	89140-802
Gentamicin-Sulfat, 10 mg / ml	Lonza	17-519Z	Add 10 Mikroliter / ml bis EpiAirway MM für die Gentamicin töten