Die Züchtung und Elektrophysiologie von Zellen auf NRCC Patch-Clamp-Chips

Zusammenfassung

Wir zeigen, wie planaren Patch-Clamp-Chips an der National Research Council von Kanada werden sterilisiert, grundiert, mit Medium geladen, mit Zellen ausplattiert, hergestellt und verwendet für elektrophysiologische Ableitungen.

Zusammenfassung

Aufgrund seiner exquisiten Sensibilität und die Fähigkeit zur Überwachung und Steuerung von einzelnen Zellen auf der Ebene der Ionenkanäle, ist Patch-Klemmung der Goldstandard der Elektrophysiologie angewendet, um Krankheitsmodelle und Pharma-Bildschirme gleichermaßen ^ein. Verfahren beinhaltet üblicherweise leicht Kontaktieren einer Zelle mit einer Glaspipette von einer physiologischen Lösung gefüllt, um einen Patch der Membran unter der Spitze ² zu isolieren. Eine Elektrode in der Pipette eingeführt erfasst Ionenkanal-Aktivität in der Membranscheibe oder, wenn gebrochen, für die gesamte Zelle. Im letzten Jahrzehnt, Patch-Clamp-Chips wurden als Alternative ^{3, 4} vorgeschlagen worden: ein aufgehängtes Film trennt die physiologischen Milieu aus dem Kulturmedium, und einer Öffnung in der Folie mikrofabrizierten ersetzt die Spitze der Pipette. Patch-Clamp-Chips haben in automatisierten Systemen integriert und auf den Markt für ^{High-Throughput-Screening-5.} Um incrzu erleichtern Durchsatz, umfassen sie die fluidischen Abgabe von Zellen aus der Suspension, deren Anordnung auf der Öffnung durch Absaugen und automatischen Routinen Zelle-zu-Probe-Dichtungen erfassen und in einen ganzen Zellen-Modus. Wir haben uns auf die Herstellung eines Silizium-Patch-Clamp-Chip mit optimierter Impedanz und Form der Öffnung, die die hochwertige Aufzeichnung von Aktionspotentialen in kultivierten Neuronen Schnecke ⁶ ermöglicht berichtet, vor kurzem haben wir auch Fortschritte bei der Vernehmung von Säugetieren Neuronen ⁷ berichtet. Unsere Patch-Clamp-Chips mit der kanadischen Photonics Fabrication Centre ^8, ein kommerzielles Gießerei hergestellt, und in großen Serien erhältlich. Wir sind gespannt, in Zusammenarbeit mit Elektrophysiologen, um die Nutzung des NKR-Technologie in verschiedenen Modellen zu validieren zu engagieren. Die Chips nach dem allgemeinen Schema in 1 dargestellt werden: der Silizium-Chip ist an der Unterseite eines Plexiglas Kultur überführt und die Rückseite der Öffnung zu einem unterirdischen chann verbundenel mit Röhren an jedem Ende des Pakets angebracht. Die Zellen werden in dem Fläschchen kultiviert und die Zelle am Anfang der Sonde durch eine Messelektrode im channel.The beiden äußeren fluidischen Schnittstellen ermöglichen Lösung Austausch mit minimaler Störung der Zelle eingefügt überwacht, das ist ein Vorteil gegenüber Glaspipetten für intrazelluläre Perfusion.

Abbildung 1. Prinzip der Messung mit dem NKR Patch-Clamp-Chip

Wir beschreiben hier, die Protokolle zu sterilisieren und zu grundieren die Chips, laden Sie sie mit mittel-, Platten sie mit Zellen, und schließlich nutzen sie für elektrophysiologische Ableitungen.

Protokoll

1. Chipherstellung

Der Prozess in ⁶ Ergebnisse in einer 3 um dicken freistehenden Film, einem niedrigen Widerstand 1 MOhm-Zugang und eine glattflächige trichterförmige Öffnung, die eine intime Dichtung mit der Zelle ⁹ erleichtert beschrieben, siehe Abbildung 2. Die Chips vereinzelt werden und verklebt Plexiglas Pakete mit der Öffnung in Richtung eines Lochs Verbinden des Chips mit einem unterirdischen Kanal. Das Kleben wird in einer Weise, die Shunt-Kapazität minimiert auf eine nominale 17 pF verzichtet. Pakete werden mit zwei 1,5 mm Durchmesser und 6 mm langen Glasröhrchen als fluidische Anschlüsse (Abbildung 3) ausgerüstet.

Abbildung 2. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von einem fokussierten Ionenstrahl Abschnitt eines NRCC Patch-Clamp-Chip zeigt eine glatte Oberfläche und Siliziumdioxid Trichterform, die intimen Kontakte Zelle begünstigt, und eine flache Öffnung, dass nur einen geringen Zugang WiderstandsthermometerE.

Abbildung 3. Ein Chip wird am unteren Rand der Kultur Fläschchen in einem Plexiglas-Paket mit unterirdischen Fluidik und Glasröhren eingebaut geklebt.

2. Sterilisation, Grundieren und Prüfung

Die folgenden Schritte sollten in einem Biologie Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um eine Verunreinigung oder Verstopfung der Öffnung zu vermeiden.

• Sterilisieren Chips in einem basischen Harrick Plasma Reiniger (www.harrickplasma.com) mit einem 0,1 bis 0,3 mbar Restdruck für 15 Min. bei einer maximalen Leistung von 18 W. Andere Luftplasma können verwendet werden mit vergleichbaren Leistungsdichte (24 mW / cm ³⁾ und wobei das Produkt der Leistungsdichte und die Zeitkonstante. Die Plasma-Behandlung macht auch die Chips hydrophil, was erleichtert die Grundierung.
• Fit Glasröhren mit sterilem Silastic Laboratory Silikonschlauch, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96.115 bis 08), 3inch auf einer Seite, 1 cm auf der anderen Seite.
• Füllen Sie Fluidik durch die Rohre mit sterilfiltriert Standard-Phosphatpuffer (PBS) darauf achten, keine Blase gefangen ist.
• Befestigen Sie den langen Silikonschlauch, während unter Druck setzen des PBS von der kurzen Seite bei 1 atm. Ein Pool von PBS sickert durch die Öffnung sichtbar sein in der Ampulle. Stecken Sie den Druck liefert der PBS und nehmen Sie den kurzen Silikonschlauch von diesem Angebot.
• Füllen Fläschchen mit gefilterter, PBS mit einer Spritze.
• Tauchen eine Ag / Ag: Cl-Elektrode in der kurzen Röhre und eine Gegenelektrode in der Ampulle. Eine Impedanz-Meter wird verwendet, um zu bestätigen, dass der Zugang Widerstand ist zwischen 300kohm und 3Mohm und der Shunt-Kapazität liegt zwischen 10pF und 25pF. Ein Chip mit einem geringeren Widerstand ist wahrscheinlich ein Leck haben, und eine höhere Kapazität gilt als nicht für den Einsatz, da sie nicht erfassen kann, die schnellste Dynamik der Zelle Elektrophysiologie ^6. Ein Chip mit einer geringeren Kapazitätoder höher wird als Widerstand angeschlossen, obwohl es könnte einfach sein, dass eine Blase in der Öffnung eingeschlossen ist. Einige Chips sind nach 1H erneut getestet und die richtige elektrochemische Impedanz haben.
• Spülen Sie das Fluidik-Kanal mit sterilem, deionisiertem Wasser; leeren Sie den Top-Fläschchen und spülen Sie mit der gleichen, zweimal.
• Tauchen Sie den verpackten Chip mit Röhren in frischem sterilem, deionisiertem Wasser für 30 Minuten laden Sie dann mit anderen Chips in einem sterilen Behälter mit sterilem, deionisiertem Wasser gefüllt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Späne hydrophilen und vor Verunreinigungen geschützt bleiben.

3. Chips Vorbereitung in der Zellbiologie-Labor

Die folgenden Schritte in einem HEPA-Filter Laminarströmungshaube unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden, müssen alle Lösungen in diesem Verfahren verwendet gefiltert vor der Anwendung mit Hilfe eines 0,22 &mgr; m-Filter sterilisiert werden.

• Öffnen Sie ein Chip-Container unter einem HEPA-Filter Laminarströmungshaube und entfernen Sie Späne von container dem Gesicht nach unten zu vermeiden Schöpfen möglich schwimmende Verunreinigungen in Top-Fläschchen.
• Spülen Sie oben auf der Chip 2x Fläschchen mit frisch gefiltert sterilem, deionisiertem Wasser, um das restliche Schmutz von der Chip-Oberfläche zu entfernen.
• Saugen Sie sterilem, deionisiertem Wasser aus der Spitze Fläschchen.
• Ein Ende des Silasticschlauch an dem fluidischen Kanal auf einem unter Druck stehenden Spritze mit sterilfiltriert entionisiertem Wasser. In unserem System sind Spritzen mit Lösung gefüllt unter Druck durch Anschluss an einen Druckluftbehälter eingestellt 20psi. Um die Sterilität zu gewährleisten, wird die Luft filtriert (0,22 um Filter) vor dem Eintritt in die Spritze und unserem System hat auch einen Ein / Aus-Ventil, das uns zu stoppen oder Druck bei Bedarf ermöglicht.
• Verwendung einer Klemme, klemmen die Ausgangsende des Schlauchs.
• Öffnen des Ein / Aus-Ventile, um die Lösung unter Druck zu setzen.
• Um die subterranen fluidischen des Chips mit frischem sterilem, deionisiertem Wasser gespült, Ausspannen das Ausgangsende des Schlauchs.
• Umce das Wasser durch die Öffnung, klemmen die Ausgangsende des Schlauchs mit einer Klemme.
• Um Wasserableitung zu vermeiden, klemmen Sie die Input-und Output Enden der Schläuche mit einem Hämostaten und schließen Sie den Ein / Aus-Ventile.
• Trennen Sie die Eingabe Ende des Schlauches aus der Spritze.
• Legen Sie Glasstopfen in beide Enden des Schlauches und entfernen Sie die Hämostaten.
• Füllen Sie oben Fläschchen mit Filter steriled deionisiertem Wasser.
• Setzen Sie den Deckel eines 35 mm sterile Schale in die Basis eines 100 mm sterile Schale
• Ort Chip auf der Oberseite des Deckels 35 mm und Deckel mit 100 mm-Schale Deckel.
• Bild-Chips, um sicherzustellen, dass die Membran und die Blende der Chips frei von Schmutz und / oder Luftblasen sind. In unserem Labor haben wir eine aufrechte Mikroskop und ein 20x-Objektiv mit großem Arbeitsabstand zu verwenden.
• Wenn Schutt und / oder Luftblasen vorhanden sind, wiederholt spülen Fluidikkanal und Top-Fläschchen. Wenn die Ablagerungen und / oder Luftblasen nicht entfernt werden kann der Chip wird verworfen.
• Sobald die Chips sindabgebildet werden, um Laminarströmungshaube zurück und ziehen Sie beide Enden des Schlauchs.
• Ein Ende des Schlauchs an einem unter Druck stehenden Spritze mit physiologischen Medien.
• Klemme die Ausgabe Ende des Schlauchs mit einer Klemme
• Druckventil öffnen, entfernen Sie die Gefäßklemme vom Ausgang Ende der Fluidik und spülen Sie die Fluidik-Kanal mit physiologischen Medien
• Um die unterirdische fluidischen mit physiologischen Medien Spülen der Ein / Aus-Ventile zu öffnen und die Gefäßklemme aus dem Ausgangsende des Schlauchs.
• Um die physiologischen Medien zwingen aufwärts durch die Öffnung, klemmen die Ausgangsende des Schlauchs mit einer Klemme.
• Klemme Eingangsende des Schlauchs mit einer Klemme zu schließen und die Ein / Aus-Ventile.
• Entfernen Sie die Eingabe Ende des Schlauches aus der Spritze und stecken Sie beide Enden des Schlauches mit Glas-Stopfen.
• Entfernen Sie die Hämostaten.
• Entfernen Sie das Wasser von oben Fläschchen.
• Füllen Sie die Top-Fläschchen mit Filter sterilisiert physiologischen Medien.
• Platzieren Sie den Chip wieder in die 100 mm Petrischale.
• Legen Sie die Basis einer 35 mm-Schale in die 100 mm-Schale und füllen Sie ihn mit Filter sterilisiert deionisiertem Wasser auf Feuchtigkeit anzureichern.
• Decken Sie die Schüssel, bis es Zeit für die Beschichtung ist

4. Zellaussaatdichten der Schnecke Neuronen

Die Patch-Clamp-Chips geeignet sein können für eine Vielzahl von Zubereitungen. Derzeit testen wir unsere Chips mit Säugetieren primären kortikalen Neuronen und erhalten haben, vorläufige Ergebnisse mit Zellen für 14 Tage ^7, was bedeutet, dass unsere Sterilisationsprotokoll angemessen ist und zeigt an, dass die Chips sind nicht im langfristigen Kulturen zytotoxischen kultiviert. Für die Zwecke dieses Protokolls wurden Schnecke Neuronen gewählt, weil sie eine einfache, aber gut etabliertes Modell zur neuronalen Elektrophysiologie ¹¹ zu studieren, zu vertreten und es ist mit diesen Zellen, dass wir die wichtigsten Ergebnisse bisher ¹⁰ erhalten. Detaillierte Zelle Isolierung und Kultivierung Verfahren habenbeschrieben zuvor ^{12, 13.}

• Entfernen Sie die äußere Schale von 2 bis 3 Monate alt Lymnaea stagnalis mit stumpfen Pinzette und Anesthetize Tiere in Lymnaea Kochsalzlösung, die 10% Listerine.

  Alle nachfolgenden Schritte durchgeführt aseptisch in einer Haube mit laminarer Strömung mit sterilisiertem Dissektion und-lösungen bei Raumtemperatur.

• Ersetzen physiologischen Medien in den Fluidik mit dem entsprechenden Recording-Lösung mit einer Eppendorf-Pipette. Im Falle von Neuronen Lymnaea die Lösung (in mM): 50 KCl, 5 MgCl _2, 5 Ethylenbis (oxyethylennitrilo) tetraessigsäure (EGTA) und 5 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES; pH 7,4 , 130 mOsm) ¹⁴
• Stecken Sie die Schnecken in eine Schüssel mit Sylgard Lymnaea Kochsalzlösung gefüllt und entfernen gesamte Gehirn wie zuvor ¹³ beschrieben
• Behandeln Sie das Isolated Gehirn in definierten Medien (DM) mit Trypsin-Enzym (0,2% Lösung, Sigma, Katalog-Nr T-9201) für 18 Minuten durch Behandlung in DM und Trypsin-Inhibitor (Sigma, Sojabohne, Katalog-Nr T-9003) für 15 Minuten.
• Stecken Sie die Köpfe in eine kleine Schüssel mit Sylgard hohe Osmolarität definierten Medien gefüllt (HODM - DM mit Glucose zugegeben, 750 &mgr; l 1 M Glucose-Lösung zu 20 ml DM).
• Mit einer feinen Pinzette und Schere Dissektion, entfernen Sie die äußere und die innere Hülle der Ganglien des Interesses, das Aussetzen der Neuronen.
• Mit Hilfe eines feuerpolierte Glaspipette mit HODM gefüllt und an einer Mikrospritze gelten sanfte Saugwirkung in der Nähe der Zelle von Interesse (linkes Pedal dorsalen 1), bis das Neuron löst aus dem Gehirn und wird in der Pipette suspendiert.
• Die Glaspipette wird dann bewegt, und tauchte in einzelne Neurochips wo sanfte Vertreibung aus der Mikroliterspritze ermöglicht die Neuronen zu sanft geschoben werden aus der Pipette und auf der Oberseite der einzelnen Patch-Löcher auf den Chips.
• Willkommen Zellen zu sitzen für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur ungestört ihre Befestigung an dem Chip die Öffnung umgebenden Fläche zu präsentieren.

5. Elektrophysiologischen Ableitungen

Um die Chips an den Verstärker anschließen (in unserem Fall ein Multiclamp 700B Verstärker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA)

• Ersetzen Sie die Lösung in der unterirdischen fluidischen und in der Chip-Fläschchen mit den entsprechenden Recording-Lösungen. Bei Lymnaea Neuronen, die oberen Kulturkammern mit Lymnaea Kochsalzlösung gefüllt (in mM: 51,3 NaCl, 1,7 KCl, 4 CaCl 2, MgCl 2 und 1,5), gepuffert auf pH 7,9 mit HEPES ^14.
• Für Stabilität, Leim der Chip auf einen Objektträger und legen Sie sie unter dem Mikroskop.
• Um den Chip an den Verstärker (in unserem Fall ein Multiclamp 700B Verstärker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) verbinden, schneiden Sie das eine Ende des Schlauchs und legen Sie eine Silver Draht ist mit dem Kopf-Stufe verbunden ist.
• Legen Sie die Referenz-Elektrode in der oberen Ampulle des Chips.
• Der Chip ist nun bereit für die Aufnahme.
• Tragen Sie eine 5 mV Schritt mit dem Verstärker zu messen Gesamtwiderstand (R _t) und bestimmen Sie die Konfiguration der Neuronen: Cell-Attached-(R _t> 1 G), Whole-Cell-(Rt = 50-100 MOhm sowie kapazitive Transienten, indikative der Blasensprung über der Öffnung); oder ohne Dichtung (R _t <5 MW). In der letzten Reihe von Experimenten ^10, 58% Prozent der Zellen mit hohem Widerstand Dichtungen hatte und von denen, zeigten 80% der Zellen erregbaren Reaktionen.

6. Repräsentative Ergebnisse

• Anwenden depolarisierende Stromimpulse (20 pA TZ) mit dem Neuron (in diesem Fall LPeD1).
• Halten Sie das Neuron bei Vm Nähe seiner Ruhepotential (~ - 60 mV).
• Beachten Sie die Antworten auf diese depolarisierenden Pulsen. Überschwingen Aktionspotentiale solltebeobachtet werden, wenn das Neuron ist lebensfähig werden.
• 4 zeigt ein repräsentatives Ergebnis die im Detail in ^{14, 15} wird diskutiert.

Abbildung 4. Spannungsantworten (oben) von einem Neuron zum LPeD1 abgestufte Reihe von intrazellulären Stromimpulse (unten). 60mV - Die Stromimpulse wurden bei Vm = angewendet.

Fehlerbehebung

• Vor der Beschichtung, um festzustellen, ob Bild-Chips Membran und Blende frei von Schmutz und geeignet für die Beschichtung sind. Wir verwenden ein aufrechtes Mikroskop und ein 20x-Objektiv mit großem Arbeitsabstand. In unserer letzten Versuchsreihe ¹ wurden 67% Prozent der Chips erfolgreich in dieser Weise grundiert.
• Wenn Schutt und / oder Luftblasen sind zu verwerfen Chip und versuchen Sie einen anderen.
• Verschiedene Oberflächenbehandlungen (Plasma) oder Beschichtungen (PDL, PEI usw.) können ausprobiert werden, aber Erfolg kann stark abhängig von Zelltypverwendet.
• Die Zusammensetzung des fluidischen ("Pipette")-Lösung in kritisch für die Bildung der Giga-Dichtung und die ganze Zellen. Passen Lösung unter Beachtung Osmolarität, pH-Wert und ionischen Make-up.
• Für längerfristige Kultur, mit den Medien in mikrofluidischen Kanal beginnen, wechseln Sie dann in Lösung vor Pipette zur Aufnahme über sanfte Schwerkraft-Perfusion (~ 0,5 ml / min).

Diskussion

NKR Patch-Clamp-Chip Verhör-Plattform ist ein potenziell mächtiges Werkzeug für hohen Informationsgehalt Pharma-Assays und in vitro-Modelle von Krankheiten zu untersuchen. Seine Vorteile im Vergleich zu Glas-Pipetten sind eine niedrige Zugriffszeit Widerstand, was ein Vorteil für große Zellen zu untersuchen ist, und trotz einer etwas größeren Kapazität wird in vergleichbarer Dynamik für kleinere Zellen führen. Spontane Zelle Öffnung Dichtungen wurden routinemäßig erhalten, und Ganzzell-Eintrag wurde beobachtet, dass spontane ¹⁴ sein. Ein deutlicher Unterschied zwischen den Chips und der Glaspipette Verfahren ist die Tatsache, dass die Sonde ein Teil der Zellkulturschale ist und nicht manuell in Kontakt mit der Zellmembran gebracht. Kultivierung von Zellen, möglicherweise Teil der funktionalen Netzwerke, führt zu mehr biologisch relevanten Modelle als Krankheitsmodelle, und ein anderer Mechanismus zur Sicherung von Hochgeschwindigkeits-Zelle zu untersuchen Dichtungen ^16. Jedoch, im Gegensatz zu Zellsuspensionen, Aspiration Cannot verwendet, um eine Zelle an der Sonde zu positionieren. Schnecke Neuronen, wie andere große Zellen, zugänglich sind, um manuelle Positionierung auf der Sonde. Für kleinere Zellen erfordern längere Kultivierungszeiten, haben wir die Notwendigkeit für Manipulationen vermieden und halten eine hohe Wahrscheinlichkeit, eine Dichtung durch Strukturieren Haftung Polypeptide auf der Sonden an Zellen auf der Sonden zu platzieren, und demonstriert die Positionierung von Zellen auf der Sonde ^17,18.

NKR ist auch die Entwicklung einer Polyimid-Mikrofluidik-Patch-Clamp-Chip ¹⁹ mit einer Kapazität vergleichbar mit der Glaspipette. Das ultimative Ziel dieses Projekts ist ein Multiple-Sonden Patch-Clamp-Chip, der die gleichzeitige Überwachung der elektrophysiologischen Aktivität mehrerer Neuronen im Verhalten des Netzwerks bei der Auflösung einzelner Ionenkanäle ^{14 in} Eingriff. Erlaubt Dieses Verfahren ist ein hoher Auflösung komplementäre Methode zur Multi-Elektroden-Arrays 20.