Method Article

Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay

DOI:

10.3791/3330

⸱

January 19th, 2012

 ,  , 
1Department of Biology, California State University, Northridge, 2Centro de Biología Celular y Molecular, Universidad Nacional de Córdoba

In This Article

Summary

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Ein Ansatz, um die Migration von explantierten Zellen (Stamm Neuralleistenzellen) analysieren beschrieben. Dieses Verfahren ist kostengünstig, leicht, und in der Lage zu unterscheiden Chemotaxis sowohl Chemokinese und andere Einflüsse auf wandernde Polarität wie die von Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des primären Stamm Neuralleiste Zellkultur abgeleitet.

Abstract

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Neuralleistenzellen (NCC) ist eine transiente Population von Zellen, die in Entwicklung von Wirbeltieren, dass aus dem dorsalen Neuralrohr (NT) auswandern nach Durchlaufen eines epithelial-mesenchymale Transition 1,2. Nach EMT, migrieren NCCs große Entfernungen entlang stereotypes Wege, bis sie ihre Ziele zu erreichen. NCCs differenzieren sich in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia, Melanozyten und Chromaffinzellen 1-3. Die Fähigkeit von NCCs zu erreichen und erkennen ihre richtigen Zielregionen für die entsprechende Ausbildung aller Strukturen mit trunk NCC-abgeleiteten Komponenten 3 grundlegend. Aufklärung der Mechanismen von Leitlinien für Trunk NCC Migration hat deshalb eine Angelegenheit von großer Bedeutung. Zahlreiche Moleküle nachgewiesen, dass NCC Migration 4 führen. Beispielsweise werden Trunk NCCs bekanntermaßen von negativen Führung Zeitgeber wie Semaphorin, Ephrin und Slit Liganden 5-8 abgestoßen werden. Allerdings sind nichtbis vor kurzem keine Lockstoffe des Rumpfes NCCs identifiziert worden 9.

Herkömmliche Ansätze zur in vitro Untersuchung der chemotaktischen Verhalten von adhärenten Zellen funktionieren am besten mit immortalisierten, homogen verteilt Zellen, sind jedoch schwieriger zu bestimmten primären Stammzellkulturen die zunächst fehlt eine homogene Verteilung und rasch zu unterscheiden (wie NCCs) anzuwenden. Ein Ansatz, um die Verteilung der Stamm NCCs für Chemotaxisstudien homogenisieren ist die Trunk NCCs aus primären NT Explantatkulturen isolieren, dann heben und replate ihnen zu fast 100% konfluent. Dies erfordert jedoch plating Ansatz erhebliche Mengen an Zeit und Mühe, um genügend Zellen Explantation, ist hart und vertreibt trunk NCCs in einem ungleichen Weise wie in in vivo-Bedingungen gefunden.

Hier berichten wir über eine in vitro Ansatz, der in der Lage, Chemotaxis und andere wandernde Reaktionen des Rumpfes NCCs ohne requirin bewerten istga homogene Zellverteilung. Diese Technik nutzt Zeitraffer-Aufnahmen von primären, unbeirrt trunk NCCs in einem modifizierten Zigmond Kammer (ein Standard Zigmond Kammer wird an anderer Stelle 10 beschrieben). Durch Belichten Trunk NCCs am Umfang der Kultur auf eine chemotactant Gradienten, die senkrecht zu ihrer vorhergesagten natürliche Richtung, können Veränderungen in wandernden Polarität durch die angelegte chemotactant Gradienten induzierte detektiert werden. Diese Technik ist kostengünstig, erfordert das Züchten von nur zwei NT je Wiederholung Explantate Behandlung vermeidet rauen Zelle Anheben (wie Trypsinisierung) verlässt Trunk NCCs in eine ähnliche Verteilung in vivo-Bedingungen, verkürzt sich die Zeitspanne zwischen Explantation und Experimente (was wahrscheinlich verringert das Risiko der Differenzierung), und ermöglicht Zeitraffer Auswertung zahlreicher wandernden Merkmale.

Protocol

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Ein. Tag 1: Isolierung von Stamm neuronalen Rohre für Übernacht-Kultur auf Deckgläsern

  1. Inkubieren chick Eier für 56 h bei 38 ° C. Entfernen Sie die Eier aus der Inkubation, leicht besprühen sie mit 70% Ethanol und dann trocknen lassen. Die Eier öffnen sich in einem UV-sterilisiert Glasschale.
  2. Extrahieren Sie jede Embryo aus Dotter und legen Sie sie in chick Ringer. Tun Sie dies, indem zuerst um seine Blutinseln mit gebogenen Schere, dann mit stumpfen Pinzette, wählen Sie die Embryos von seinem extraembryonalen Membran und legen Sie sie in einem sterilen Petrischale mit chick Ringer-Lösung.
  3. Isolieren den Kofferraum jedes Embryos durch Tr....

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Discussion

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Dirigieren Chemotaxis Forschung am Stamm NCCs erwiesen Herausforderung für eine Reihe von Gründen. Trunk NCCs sind eine heterogene Stammzellen Bevölkerung unterscheiden, ob kultivierten langfristigen wird, daher trunk NCCs aus primären Explantation des Stamm-Ebene NT eingeholt werden muss. Herkömmliche Verfahren, die chemotaktische Reaktion von homogen verteilt Zellpopulationen in vitro zu untersuchen sind schwierig auf Trunk NCCs testen, da sie zuerst erforderlich, dass Zellen getrennt und homogen wiederplatti.......

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Disclosures

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

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Wir geben besonderen Dank an Lino Kim, Steve Guzman und Ujit Satyarthi für die technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode. Myron Hawthorne, Richard Spengel und Roberto Rojas bearbeitet die Kammern verwendet hier und dringend benötigte technische Unterstützung. Bemerkenswert ist, produziert Roberto Rojas Abbildung 4. Wir sind auch dankbar für wertvolle Ratschläge Scott Fraser vor der Entwicklung der oben genannten Chemotaxis Assay. Diese Arbeit wurde teilweise durch eine NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13 bis MEDB und durch eine Auszeichnung von der CSU, Northridge Diplomarbeit Support Program CW unterstützt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare (optional)
DMEM Omega Scientific DM-22
Penicillin Streptomycin-Lösung Omega Scientific PS-20 100X Lager Konzentration
L-Glutamin Omega Scientific GS-60 100X Lager Konzentration
Fötales Rinderserum Omega Scientific FB-11 Lot # 105247 (oder eine andere, die vergleichbar ist)
Modified Zigmond Kammer Hausgemachte N / A Behältervolumen: ~ 160 ul ea, für zusätzliche Spezifikationen, siehe Abb. 4 und die ergänzende Herstellung Protokoll
Zellkulturschale Denville T6040 40 x 10 mm
Fibronectin BD 354008 10X Lager vorbereitet durch Verdünnen von 1 mg FN in 1 ml H 2 O und 9 ml DMEM
Deckgläser Fischer 12-548-B Vorgereinigt; 22 x 22 mm
L15 Medium Thermo Scientific SH30525.02
Petroleum Jelly Comforts 011110794642 100%
Zentrifugenröhrchen Biologix 10-9152 15 ml
Dispase Cell Systems 4Z0-850 10X Lager Konzentration
Spritze BD 309602 1 ml
Nadel BD 305127 25 G x 1,5 Zoll
Alexa Fluor 488-IgM Ichnvitrogen A21042 Stock ist 2 mg / ml; 7 Mol Farbstoff / Mol IgM
Dissektionszangen FST Misc. Dumont # 5 oder 55; geraden gekippt; Edelstahl oder Titan
Tungsten Needle N / A N / A Hausgemachte; platziert in einem Stifthalter
Blunt Forceps Tiemann 160-18 Wird für die Übertragung Embryonen Ringer aus Eigelb

Supplemental Protokoll: Herstellung eines Modified Zigmond Kammer

Bitte beachten Sie 4 als Referenz für das Protokoll in der folgenden Abbildung:

  1. Erwerben Sie ein Blatt 3/16 "dick poliert Acryl (4,45 mm tatsächliche Dicke).
  2. Mit einer Tischkreissäge, schneiden Kammer Rohlinge überdimensioniert, um den groben Abmessungen von 33,25 mm x 64,57 mm. Dies ermöglicht 3,175 mm zusätzliches Material für die Bearbeitung.
  3. Die Kammer leer auf einer vise. Mit einer Fräsmaschine und einer 6,35 mm (1/4 ") end mill bit, Fertigbearbeitung die Seiten der Kammer, um ihre genauen Abmessungen: 30,07 mm x 61,39 mm.
  4. Positionieren Sie die Kammer leer auf der Fräsmaschine und suchen Sie die Mitte des Rohlings entlang der x-und y-Achse mit einem Kantentaster, dann Null das Stadtzentrum.
  5. Erwerben die Kammer Höhe (z-Achse) durch Berühren des Schaftfräsers Bit auf der oberen Fläche und die Höhe Null.
  6. Verwendung einer 3,91 mm (0,154 ") Schaftfräser Bit, das Bit-Offset 3,03 mm entlang der x-Achse (positive Richtung) für das erste Reservoir. Begin Bearbeitung in die Kammer bis zu einer Tiefe von 2,84 mm während der Bewegung entlang der y-Achse ( positive Richtung) bis 7,62 mm (0,300) ") und dann zu 7,62 mm (0,300 durchqueren" in der entgegengesetzten (negativen) Richtung bis zu einem vollständigen Reservoir Länge von 15,24 mm (0,600 "). Offset das Bit auf 3,03 mm (0,119 ") entlang der x-Achse (negative Richtung) und wiederholen Sie den Vorgang für das zweite Reservoir.
  7. Positionieren Sie die Kammer an ihrem Randund Bohren eines Loches mit einem 1,09 mm (0,043 Zoll) Bohrmeißel am Ende eines jeden Behälters (4 total), das das Ende des Reservoirs verbindet zu der Seite der Kammer für das Laden Medium während Experimentieren.
  8. Weichen Sie die Kammer auch in warmem Seifenwasser zu helfen, entfernen Sie keine chemischen Verunreinigungen.
  9. Spülen Sie die Kammer auch in doppelt destilliertem Wasser keine Seife entfernen. Die Kammern sind jetzt einsatzbereit wie oben beschrieben.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
  2. Baker, C. V. Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , 4th edn, Springer. ....

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Trunk Neural CrestNeural TubeModified Zigmond ChamberChemotaxis AssayTime lapse ImagingCell Migration AnalysisImage J TrackingNeural Crest IsolationMolecular GradientMigratory Polarity

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