Parasitoiden (parasitäre) Wespen stellen eine große Klasse von natürlichen Feinde vieler Insekten einschließlich Drosophila melanogaster. Wir stellen Ihnen die Techniken, diese Parasiten in propagieren Drosophila Spp. und demonstrieren, wie man ihre Wirkung auf das Immunsystem Gewebe analysieren Drosophila Larven.
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Methodenartikel
Eine Einführung in die parasitischen Wespen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die meisten bekannten Arten parasitärer Schlupfwespen befallen die Larven- oder Puppenstadien von Drosophila. Während Trichopria drosophilae die Puppenstadien des Wirts befällt (Abb. 1A–C), greifen Weibchen der Gattung Leptopilina (Abb. 1D, 1F, 1G) und Ganaspis (Abb. 1E) die Larvenstadien an. Wir nutzen diese Parasiten, um die molekularen Grundlagen eines biologischen Wettlaufs zu untersuchen. Parasitische Schlupfwespen besitzen einen hohen Wert als biologische Kontrollagenten. Die meisten von ihnen tragen Virulenzfaktoren und andere Faktoren, die die Physiologie und Immunität des Wirts verändern. Die Analyse von Drosophila-Schlupfwespen liefert Erkenntnisse darüber, wie artenspezifische Interaktionen die genetischen Strukturen natürlicher Populationen prägen. Diese Studien dienen zudem als Modell, um die Immunphysiologie der Wirte und die Art und Weise zu verstehen, wie koordinierte Immunreaktionen durch diese Klasse von Parasiten unterlaufen werden.
Die larvale/pupale Kutikula bildet die erste Verteidigungslinie. Der Eileger der Wespe ist eine nadelförmige, scharfe Struktur, die Eier effizient in den Hämocöl des Wirts einführt. Auf die Eiablage folgt eine Wundheilungsreaktion an der Kutikula (Abb. 1C, Pfeilspitzen). Einige Wespen können zwei oder mehr Eier in denselben Wirt legen, obwohl sich nur ein Ei weiterentwickelt. Überzählige Eier oder sich entwickelnde Larven werden durch einen bislang nicht verstandenen Prozess eliminiert. Diese Wespen werden daher als solitäre Parasitoide bezeichnet.
Je nach Fliegenstamm und Wespenspezies erleidet das Wespenei eines von zwei Schicksalen. Es wird entweder eingeschlossen, sodass seine Entwicklung blockiert wird (Wirt schlüpft; Abb. 2 links); oder das Wespenei schlüpft, entwickelt sich, häutet sich und wächst zu einem erwachsenen Tier heran (Wespe schlüpft; Abb. 2 rechts). L. heterotoma ist eine der am besten untersuchten parasitären Wespenspezies von Drosophila. Sie ist ein „Generalist“, was bedeutet, dass sie die meisten Drosophila-Arten als Wirte nutzen kann1. L. heterotoma und L. victoriae sind Schwesterarten und produzieren virusähnliche Partikel, die aktiv in die Einschließungsreaktion eingreifen2. Im Gegensatz zu L. heterotoma ist L. boulardi ein Spezialisten-Parasit, und das Spektrum an Drosophila-Arten, die sie nutzt, ist relativ begrenzt1. Stämme von L. boulardi produzieren ebenfalls virusähnliche Partikel3, unterscheiden sich jedoch erheblich in ihrer Fähigkeit, bei D. melanogaster erfolgreich zu sein1. Einige dieser L. boulardi-Stämme sind schwer auf D. melanogaster zu züchten1, da der Fliegenwirt häufig erfolgreich ihre Eier einschließt. Daher ist es wichtig, über das Wissen beider Partner in bestimmten experimentellen Protokollen zu verfügen.
Neben Barriergeweben (Cuticula, Darm und Tracheen) verfügen Drosophila-Larven über systemische zelluläre und humorale Immunantworten, die jeweils auf der Funktion von Blutzellen und des Fettkörpers beruhen. Die Eiablage durch L. boulardi aktiviert beide Immunarme1,4. Blutzellen finden sich im Kreislauf, in sessilen Populationen unterhalb der segmentierten Cuticula sowie in der Lymphdrüse. Die Lymphdrüse ist ein kleines hämatopoetisches Organ an der dorsalen Seite der Larve. Gruppen hämatopoetischer Zellen, sogenannte Lappen, sind segmental paarweise entlang des dorsalen Gefäßes angeordnet, das sich entlang der anterioren-posterioren Achse des Tieres erstreckt (Abb. 3A). Der Fettkörper ist ein großes multifunktionales Organ (Abb. 3B). Er sekretiert antimikrobielle Peptide als Reaktion auf mikrobielle und metazoische Infektionen.
Die Infektion mit Wespen aktiviert die Immunsignalübertragung (Abb. 4)4. Auf zellulärer Ebene löst sie Teilung und Differenzierung von Blutzellen aus. Zur Selbstverteidigung bilden sich Aggregate und Kapseln im Hämocoel infizierter Tiere (Abb. 5)5,6. Aktivierte Blutzellen wandern zur Wespenlarve (oder zum Wespeiei) und beginnen, eine Kapsel darum zu bilden (Abb. 5A–F). Einige Blutzellen aggregieren und bilden Noduli (Abb. 5G–H). Eine sorgfältige Analyse zeigt, dass die Infektion mit Wespen die am weitesten anterior gelegenen Lappen der Lymphdrüse dazu veranlasst, sich an ihren Rändern aufzulösen (Abb. 6C, D).
Wir präsentieren repräsentative Daten zu Komponenten des Toll-Signaltransduktionswegs, Dorsal und Spätzle (Abb. 4,5,7), sowie dessen Zielgen Drosomycin (Abb. 6), um zu veranschaulichen, wie spezifische Veränderungen in der Lymphdrüse und im Hämocoel nach einer Infektion mit Schlupfwespen untersucht werden können. Die hier beschriebenen Präparationsprotokolle ermöglichen zudem die Gewinnung der Wespeneier (oder entwickelnden Stadien der Wespen) aus dem Hämolymphe des Wirts (Abb. 8).
Protokoll
Die gesamte Protokoll für das Experiment ist in vier Schritte (Abb. 9) unterteilt ist. (1) Die Züchtung Wespen auf Fliegenlarven, (2) Die Einrichtung Infektionen und die Vorbereitung für Tiere Dissektion; (3) Isolierung und Fixierung Wirt / Parasit Strukturen, (4) Analyse der Immun-Gewebe.
1. Die Züchtung Wespen auf Drosophila-Larven
Wartung der Wespe Kulturen erfordert eine sorgfältige Planung. Relativ zum wachsenden fliegt, ist es ziemlich arbeitsintensiv. Wir bleiben bei unserer Wespe Kolonien im Labor auf Larven oder Puppen des yw-Stamm von Drosophila bei 24 ° C Di....
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Diskussion
Das Interesse an Schlupfwespen von Drosophila wird als molekulare Techniken, um ganze Genome entschlüsseln werden effiziente und kostengünstige sprunghaft zu. Jedoch im Verhältnis zu ihrem außergewöhnlich gut untersuchten Gastgeber, bleiben viele faszinierende Aspekte der Biologie Wespe im Dunkeln. Dazu gehören Fragen im Zusammenhang mit Reichweite, Immunsuppression, Superparasitismus und Verhalten zu hosten. Der Schwerpunkt dieser Präsentation war es, die Auswirkungen der Infektion auf der Fliege Immunsystem G.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Prof. Todd Schlenke für Trichopria drosophilae, Prof. Tony Ip für transgene Fliegen-Stämmen, und Prof. Carl Hashimoto für anti-Spätzle-Antikörper. Wir bedanken uns bei gegenwärtigen und früheren Mitgliedern des Labors für ihre Beiträge zu dieser Präsentation. Vom NIH (GM08168 S06, RISE 41399-009 und G12-RR03060), USDA (NRI / USDA CSREES 2006-03817 und 2009-35302-05277) und PSC-CUNY: Diese Arbeit wurde von den folgenden Zuschüssen unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Materialien | Typ | Firma | Katalog-Nummer |
| Materialien für Insekten Kultur Wartung | |||
| Hefe | Aktive Trockenhefe | Fisher Scientific | S802453 |
| Fly Lebensmittel | Maismehl, Zucker | Standard-Rezept | |
| Honig | Klee | Niederländischen Gold- | |
| Vials | Sitzschale aus Polypropylen Ampullen (schmal) | Fisher Scientific | AS514 |
| Vial Schließungen | Wattestopfen | Fisher Scientific | AS212 |
| Vial Schließungen | Buzz-Stecker | Genesee Scientific | AS273 |
| Kühlbrutschrank | Precision 815 | Thermo Scientific | 3721 |
| Materialien für die Probenvorbereitung | |||
| CO 2-Tank | Knochentrocken Klasse | TW Smith | UN1013 |
| Spachtel | Micro Spatel (14 cm) | Fisher Scientific | 21-401-15 |
| Pyrex Spot Testplatten | 9-gut sezieren Platte 85 mm x 100 mm | Thomas Scientific | 7812G17 |
| Pasteurpipetten | Atemkalk | J & H Berge | 71-5200-05 |
| Zange | Style # 5 | Sigma | T-4662 |
| Ethanol | 190 Beweis USP | Fisher Scientific | 04-355-221 |
| Formaldehyd | 37% w / w | Fisher Scientific | F79-1 |
| Sekundärer Antikörper Cy3 AffiniPure Esel-anti-Kaninchen-IgG (H + L) | 01.50 Excitation 546 nm; Emission 565 nm | Jackson Immuno Research Laboratories, Inc. | 711-165-152 |
| Antifade (N-Propylgallat) | 4 ug / ml in 50% Glycerin in 1X PBS | MP Biomedicals | 10274790 |
| Glycerin | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Hoechst 33258 | 0,2 ug / ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm | Molecular Probes | H-1398 |
| Rhodamin-Phalloidin | 200 Einheiten / ml (6,6uM) Excitation 540 nm; Emission 565 nm | Molecular Probes | R415 |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | 300 Einheiten / ml Excitation 495 nm; Emission 518 nm | Molecular Probes | A12379 |
| Verbrauchsmaterial | |||
| Waschflasche | Fisherbrand | Fisher Scientific | 03 bis 409-22A |
| Kimwipes | Kimberly Clark | Fisher Scientific | 06-666A |
| Papierhandtuchspender | 1-lagig C-Falz | Federkiel | 901-7CFTB2400 |
| Mikroskopie | |||
| Leica Stereomikroskop | MZFLIII | Reich Imaging Systems, Inc. | 10446208 |
| Zeiss Stereomikroskop | Stemi 1000 oder 2000-C | Carl Zeiss | 000000-1006-126 |
| Light Source - LED | Schwanenhals-Hilfslicht | Fisher Scientific | 12563501 |
| Bühne | Durchlicht-Box mit Platte | Carl Zeiss | 455137000 |
| Zeiss Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop | LSM 510 | Carl Zeiss | |
| Zeiss zusammengesetzte Mikroskop | Axioplan 2 aufrecht | Carl Zeiss |
| Wespen-Stämme | Fly abseihens |
|---|---|
| Leptopilina victoriae 16 | yw |
| Leptopilina boulardi 17 1 | UAS-GFP-Dorsal 17 |
| Leptopilina heterotoma 2 | SerpentHemoGal4 13 |
| Leptopilina heterotoma 14 1 | MSNF9-moCherry 14 |
| Trichopria drosophilae | MSNF-GFP 15 |
| Ganaspis xanthopoda 18 | yw Serpent UAS-Gal4 GFP-Dorsal/Basc 4 |
| yw; Drosomycin-GFP/CyO y + 12 |
Referenzen
- Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
- Chiu, H., Morales, J., Govind, S.
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Nachdrucke und Genehmigungen
