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Summary

Parasitoiden (parasitäre) Wespen stellen eine große Klasse von natürlichen Feinde vieler Insekten einschließlich<em> Drosophila melanogaster</em>. Wir stellen Ihnen die Techniken, diese Parasiten in propagieren<em> Drosophila</em> Spp. und demonstrieren, wie man ihre Wirkung auf das Immunsystem Gewebe analysieren<em> Drosophila</em> Larven.

Abstract

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts’ immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.

The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.

Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a “generalist,” which means that it can utilize most Drosophila species as hosts¹. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response². Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited¹. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles³ although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster¹. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster¹ as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.

In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms^1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.

Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)⁴. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)^5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).

We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Spätzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

Protocol

Die gesamte Protokoll für das Experiment ist in vier Schritte (Abb. 9) unterteilt ist. (1) Die Züchtung Wespen auf Fliegenlarven, (2) Die Einrichtung Infektionen und die Vorbereitung für Tiere Dissektion; (3) Isolierung und Fixierung Wirt / Parasit Strukturen, (4) Analyse der Immun-Gewebe.

1. Die Züchtung Wespen auf Drosophila-Larven

Wartung der Wespe Kulturen erfordert eine sorgfältige Planung. Relativ zum wachsenden fliegt, ist es ziemlich arbeitsintensiv. Wir bleiben bei unserer Wespe Kolonien im Labor auf Larven oder Puppen des yw-Stamm von Drosophila bei 24 ° C Die Züchtung Wespen gehört es, eine kontinuierliche Quelle für Hosts im richtigen Stadium und Löschen der "infizierten" Fläschchen mit Fliegen, die Wespen zu tun, bevor die auftauchen. Wespen folgen dem haplodiploid Methode der Geschlechtsbestimmung und deshalb ist es wichtig, dass die Weibchen verpaart werden, bevor sie die Wirte zu infizieren.

1. Am Tag 1, fügen Sie einen kleinen Klecks frisch vorgegenüber Hefe-Paste (hergestellt durch Mischen von 1 ml Wasser in etwa 1 g der Trockenhefe in eine frische Lebensmittel Fliege Fläschchen Das Rezept der Fliege Essen ist nicht kritisch;. wir wachsen Fliegen an der corn-meal/sucrose/agar Medium. Platz 50 bis 60 jungen (2-4 Tage alten) Erwachsenen yw (oder anderen wesentlichen Wildtyp-Stamm) fliegt, um Eier zu legen für 48 Stunden bei 24 ° C
2. Am Tag 3, entfernen Sie die Fliegen von den Fläschchen. Legen Sie eine Buzz-Stecker auf der Flasche mit einem Tropfen Honig auf der Innenseite des Buzz-Stecker. Honig wird 2:1 in destilliertem Wasser verdünnt.
3. Verwendung von CO _2, betäuben die Wespen und sortieren 6-8 und 6-8 Weibchen Männchen, die in etwa 2-3 Tage alt sind. Legen Sie sie in das Fläschchen mit 0-48 Stunden alt Gastgeber. Beachten Sie, dass Wespen empfindlicher auf _zwei Fliegen als CO sind, und Sie haben können, ihr Engagement in der Gas kalibrieren. Drosophila-Forscher nicht mit einem Standard Drosophila Anästhesie-Station-Design. Ein guter Ausgangspunkt, um Wespen betäuben ist es, die CO _2-Druck eingestelltum etwa die Hälfte dessen, was für betäubende Fliegen benötigt.
4. Ersetzen Sie die Buzz-Stecker (mit Honig) auf dem Fläschchen. Vorsichtig platzieren Sie das Fläschchen auf die Seite legen, bis die Wespen aufwachen.
5. Legen Sie diese Fläschchen mit Fliegenlarven und Wespen in einem 24 ° C Inkubator.
6. Erfolgreiche Infektionen wird Puparium geringfügig verzögern. Hosts, die Wespe Angriff erlitten haben, aber in der Lage sind, sich zu verteidigen (oder, wenn sie nicht infiziert sind), die Entwicklung fortzusetzen nach dem normalen Zeitplan und erwachsenen Fliegen entstehen aus diesen Puparien deutlich vor den Wespen.
7. Je nach Temperatur und Wespenarten, Wespen schlüpfen in 25-30 Tagen.
8. Entfernen Sie die erwachsenen Fliegen aus den Fläschchen, in denen Wespen entwickeln.

2. Einrichten Infektionen und Vorbereiten von infizierten Tieren zur Präparation

Bevor Sie beginnen, haben ein paar saubere Glas-oder Kunststoff-Petrischalen, ein Sezieren Pyrex Schüssel mit 9 Vertiefungen, Kimwipes, destilliertem Wasser (aus einer Spritzflasche), 70% Ethanol (in einer Spritzflasche), 1x PBS (in einer Spritzflasche), Objektträger, und ein kleines, handliches sauberen Spatel.

1. Zum Einrichten Infektionen, führen Sie die Schritte 1-5 oben. Je nach Experiment, kann es notwendig sein, Hosts, die in etwa der gleichen Phase der Entwicklung befinden verwenden. Dazu kann egglays von 2-6 Stunden für eine Infektion verwendet werden.
2. Um infizierte Larven (zum Sezieren von Immun-Gewebe oder Parasiten) ernten, entfernen Sie die Inhalte der Fliege in ein kleines Fläschchen aus Glas oder Kunststoff-Petrischale.
3. Mit einem Stereomikroskop und feinen Pinzetten (Pinzette), sorgfältig auswählen 6-10 Larven, einer nach dem anderen und legen Sie sie in eine Depression auch mit 1X PBS, dann übertragen Sie sie ins Wasser, 70% Ethanol, Wasser und 1X PBS, nacheinander. Der Zweck dieser Maßnahmen ist es, die Tiere der Fliege Nahrung zu befreien und gründlich zu reinigen und zu sterilisieren ihrer Oberfläche. Die in Wasser zu spülen verdünnt das Ethanol und das abschließende Spülung in PBS entfernt das Ethanol. Für Schritt 3 unten ist es am besten nicht auf das verlassenTiere in PBS für länger als 10 Minuten.

3. Isolieren und Beheben von Wirt / Parasit Strukturen

Hintergrund

Die Larven Lymphdrüse ist ein kleines Organ hämatopoetischen ^7. Auf dem dritten Larvenstadium, enthält die Lymphdrüse ein großes Paar Vorderlappen, dass die Flanke dorsalen Gefäß (Abb. 3A, 6B-C, 7a-d). Die Vorderlappen sind weiter in spezialisierte Regionen mit einzigartigen Eigenschaften von Zellen ⁷ aufgeteilt. Vorfahren der drei Zelltypen, plasmatocytes, Lamellozyten und Kristall-Zellen in den Vorderlappen befinden. Pericardial Zellen trennen die Vorderlappen aus den kleineren hinteren Lappen. Die Drosophila Lymphdrüse ist ein Modell für Insekten-und Säuger Hämatopoese ^8,9.

Fett Körper ist funktionell ähnlich der Leber des Säugetiers. Die humorale Antwort wird im Fettkörper folgenden mikrobiellen oder Wespe ^1,4,10 Infektion ausgelöst. AlsDementsprechend werden eine einzigartige Kombination von antimikrobiellen Peptid-Gene aktiviert, und die Peptide werden in der Hämolymphe ¹ sekretiert. Der Fettkörper ist auch die primäre Gewebe für Glykogen und Triglycerid-Produktion und Lagerung ^11. Die larvalen Fettkörper nimmt erhebliche Mengen in Haemocoel und, so ganz anders als der Lymphdrüse, ist es leicht zu finden. Wir werden nun zeigen, wie man die Lymphdrüse und das Fett vom Körper dritten Larvenstadium zu sezieren.

Bevor Sie beginnen

Brauchen feinen Pinzetten (Pinzette) und Ethanol gereinigt Objektträger.

Larven Lymphdrüse Dissektion

1. Mit einer feinen Pinzette, wählen Sie eine Wanderung dritten Larvenstadium in 1X PBS aufbewahrt.
2. Legen Sie die Larve auf einen Objektträger.
3. Mit einer Pinzette, positionieren Sie das Tier mit der Bauchseite auf.
4. Die Verwendung von zwei Paaren von Zangen, halten das Tier auf beiden Seiten des hinteren Endes (Pfeilspitzen 1, Abb. 3A) und gently ziehen Sie die Nagelhaut, um eine kleine, oberflächliche Riss in der Kutikula einzuführen.
5. Die Hämolymphe, die Blutzellen, Darm und fetten Körper beginnen, aus der Körperhöhle zu entkommen. Die Hämolymphe kann mit einem 10 pl "pipetteman", um Abstriche zu machen, bei Bedarf eingenommen werden.
6. Platzieren beide Zangen auf der rechten Seite des Tieres unter den Mund Haken (Pfeilspitzen 2, Abb. 3A), die Nagelhaut sanft reißen.
7. Bewegen Sie beide Zangen auf die linke Seite des Tieres unter den Mund Haken (Pfeilspitzen 2, Abb. 3A) und vorsichtig einen weiteren kleinen Riss.
8. Halten Sie den Mund des Tieres Haken, ziehen Sie vorsichtig die Nagelhaut nach unten in Richtung des hinteren Endes des Tieres (als ob es wieder Peeling).
9. Da die Nagelhaut zurück gezogen wird, wird das Gehirn, fetten Körper, Imaginalscheiben, Speicheldrüsen, und proventriculus werden ausgesetzt. Das freistehende Nagelhaut ist nun am hinteren Ende, sondern haben auch weiterhin die dorsalen Gefäß mit der Lymphdrüse attached to it. </ Li>
10. Schneiden Sie den Vormagen und verschieben Sie sie weg von der Lymphdrüse Bereich. Die Lymphdrüse wird unterhalb des Gehirns, obwohl Sie möglicherweise nicht in der Lage, es zu sehen.
11. Sorgfältig necken entfernt das Fett Körper, Darm, Speicheldrüsen und anderen Strukturen, die auf die Drüse werden kann sitzen. Achten Sie darauf, die Lymphdrüse aus dem Ring Drüse und der dorsalen Gefäß befindet sich hinter dem Gehirn zu lösen. Die Lymphdrüse wird flach werden gegen den Objektträger.
12. Entfernen Sie sorgfältig alle zusätzlichen Gewebe entfernt von der Lymphdrüse, bis die gesamte Drüse entfaltet sich aus den Vorderlappen bis zum Abschluss der Perikard-Zellen.

Hinweis: Eine gut präpariert Lymphknoten wird ein Paar von vorderen Lappen und zwei Sätze von hinteren Lappen entlang der dorsalen Gefäßes (6B) aufweisen. Die Lappen können leicht beschädigt werden oder herabfallen kann aus dem dorsalen Gefäß. Die Proben sollten daher mit großer Vorsicht behandelt werden. Die Drüse auch hals Tendenz zu schrumpfen oder Vertrag. Sanft Begradigung der Orgel an ihrem hinteren Ende erlaubt für alle Teile und Zellen gut präsentiert werden. Dies ist insbesondere erforderlich für die Immunfärbung Protokolle.

Fay Körper Dissektion

1. Auf der Sezieren Bühne des Zeiss 1000 Seziermikroskop (jede Stereo Binokular verwendet werden kann), platzieren Sie einen Leuchtkasten, der einfallendes Licht durch die Probe übertragen werden können. Positionieren Sie ein drittes Larvenstadium von Schritt 2 auf einem Objektträger in 200 ul 1X PBS. Kippen der Lichtquelle von der Probe entfernt, so dass der Organismus erscheint transparent und daher ist es leicht, den inneren Organen zu visualisieren.
2. Mit einer Pinzette, die Position des Tieres, so dass das vordere Ende ist weg von dir.
3. Mit einer Pinzette, halten die Schuppenschicht der Larve auf der linken Seite seines Mundes Haken (Pfeil 1, Abb. 3B). Mit den anderen Zangen, sanft die Nagelhaut reißen den ganzen Weg bis zum hinteren Ende (arrowhead 2, 3B). Nicht reißen die Nagelhaut weg vom Körper am hinteren Ende.
4. Sehr sanft beginnen Entfernen der Darm zur Seite.
5. Entfernen Sie vorsichtig das Gehirn, Imaginalscheiben und den Ring Verschraubung mit der Lymphdrüse, die durch den dorsalen Gefäß.
6. Entfernen Sie nicht die Speicheldrüsen, da es Fettkörper Einhaltung dieser Drüsen.
7. Entfernen Sie vorsichtig die Nagelhaut und verlassen den Körper Fett auf der Folie in 1X PBS.

Anmerkung 1: Der Fettkörper nur eine Zellschicht und es ist daher wichtig, dass alle Zellen in der gleichen Ebene auf dem Objektträger abgeflacht. Die Zellen sind endopolyploid und einfach zu visualisieren. Ein gut präpariert Fettkörper Probe sollte Aufrechterhaltung des normalen Zell-Kontakte, und eine minimale Fettkügelchen in der Umgebung des präparierten Probe (Abb. 6I, J) haben.

Hinweis 2: Wenn Wespe Eier unberührt von dem Immunsystem des Wirts zu bleiben, werden sie initiate-Entwicklung fast sofort. Frühen Entwicklungsstadien des Parasiten (von der Host-Larve) sind leicht zugänglich von der sezierten Haemocoel (Abb. 8). Parasite Eier oder Larven entweder auf den Körper Fett oder anderen Organen anhaften, oder einfach auf den Objektträger schlüpfen während der Dissektion.

4. Analyse Immune Gewebe

1. Der Luft trocknen lassen Lymphdrüsen für 5-10 min und entfernen 1X PBS aus der fetten Körper Rutsche vor der Befestigung für 5-10 Minuten mit 4% Paraformaldehyd in PBS hergestellt. Jede Seite kann mehrere sezierten Lymphknoten für die Färbung. Bewegen Sie Objektträger mit den fixierten Proben in eine hausgemachte feuchten Kammer für die weiteren Schritte. Diese Kammer wird, indem zwei Stücke von gefalteten, feuchten Papiertüchern am unteren Rand eines leeren Kunststoff Mikropipettenspitze Box vorbereitet. Eine oder mehrere Folien mit Mustern kann auf der Oberseite der Trennwand zum Halten der Spitzen verwendet platziert werden.
2. Als solche ist die Analyse der Immun-Gewebe nach Standardmethoden durchgeführt, dasskombinieren in vivo Markierung von Zellen und indirekte Immunhistochemie ^4.

5. Repräsentative Ergebnisse

1. Wespen-Infektion aktiviert die Expression des Toll-Weg Reporter Drosomycin-GFP (Abb. 6G, J). In diesem Experiment ist die Wirkung von Wespen-Befall auf die Genexpression in vivo sichtbar gemacht mit einem GFP-Reporter im Zusammenhang mit der Drs. ¹² Promoter. Bei nicht-infizierten Kontrolltiere wird das GFP-Expression nicht erkannt. Das GFP-Signal ist eindeutig in Zytoplasma und Nukleus der Zellen des Fettkörpers entdeckt, seziert von Tieren, die mit L. infiziert victoriae. Um die besten Ergebnisse, das Verhältnis von Wespen zu erhalten: Gastgeber sollten 1:10. Die Infektion sollte für mindestens 2 Stunden dauern. Beitrag Befall sind die DRS-GFP-Signal stärker wird und viele Fett Körperzellen GFP-positive sogar bis zu 72 Stunden ^1,4.
2. Wespen-Infektion induziert die Differenzierung von Lamellozyten in der lymph Verschraubung (6D). Lamellozyten umzingeln und zu blockieren Wespe Entwicklung (Abb. 6H). Lymphdrüsen werden seziert, um die zellulären Veränderungen in den Vorderlappen nach L. induziert visualisieren victoriae Infektion. Neu getrennte Lamellozyten vorhanden sind am Umfang der präparierten Lappen; Lamellozyten mit einem GFP-Transgen, die durch die verformte Enhancer (MSNF9-GFP) angetrieben wird, gekennzeichnet. Alle Zellen werden visualisiert mit filamentösen Aktin mit Rhodamin-markierten Phalloidin. Beachten Sie, dass die Integrität der Vorderlappen in diesen Drüsen der Basalmembran, die normalerweise umgibt die Keule kontinuierlich (6C) unterbrochen ist, ist nun diskontinuierliche (6D). Von den gleichen Sektionen können Lamellozyten in der Hämolymphe auch sichtbar in Abstrichen (Abb. 6G), von denen einige mit der Kapsel gebildet, um die Entwicklung von Parasiten (6H)-Block zugeordnet.
3. Spätzle Protein wird in den meisten Zellen des larvalen Lymphdrüse (7C, D) ausgedrückt. Um Spz in den sezierten Lymphknoten zu detektieren, gefolgt wir ein Standardprotokoll zum Färben von Zellen der Lymphknoten mit polyklonalen Anti-Antikörper Spz ^4. In vivo Spz Ebenen Erhöhung Lymphknoten-Zellen nach Infektion Wespe (Platten Bild zu vergleichen. 7C, E mit 7G, I, und Panels 7D, 7H mit F, J).
4. Frühe und späte Stadien der Entwicklung von Host-Wespe Larven und Puppen (Abb. 8). Um Entwicklungsstadien der Wespen zu untersuchen, werden infizierte Larven zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Eiablage seziert. Hier zeigen wir eine Abtastrate von diesen Stufen aus Leptopilina spp. Aus infizierten Wildtyp D. melanogaster hostet.

<br /> Abbildung 1. Verschiedene Wespenarten und Eiablage der Wespe Ei. Alle Bilder wurden mit einem Leica Stereomikroskop. Ein Trichopria drosophilae weiblichen Wespe oviposits Ei in eine D. melanogaster Puppe. B Vergrößerung der Eiablage von Trichopria drosophilae in Host-Puppe. C melanisierten Punkte zeigen die Wundheilung an der Stelle der Eiablage. D L. boulardi männlich. E G. xanthopoda weiblich. F L. victoriae weiblich. G L. heterotoma Männchen (links) und weiblich.

Abbildung 2. Lebenszyklen, die die Fliege / Wespe Wettrüsten. Eiablage Ergebnisse in einem von zwei Ergebnissen. Entweder Host Immunreaktionen gelingen, die Entwicklung von der Wespe (links), oder die Wespe vereitelt blockieren das Immunsystem des Wirts RespoNSEs und es gelingt ihm (rechts). Geändert von Melk und Govind, 1999 ^18.

Abbildung 3. Drittes Larvenstadium, welche die Organe des Interesses vor der Dissektion. Alle Bilder wurden mit einem Leica Stereomikroskop. Ein hml> GFP-Larve mit GFP (grün) Fluoreszenz (Pfeil) in einzelnen Zellen der Lymphdrüse die allgemeine Lage der Lymphdrüse zeigt in einem intakten Tier. Die Larve wurde mit Fluoreszenz-und Hellfeld-Optik abgebildet. Pfeilspitzen weisen auf Standorte wichtig für die Lymphdrüse Dissektion Protokoll im Text beschrieben. B Cg> GFP-Larve mit GFP-Expression in den fetten Körper, um die Position der Orgel in einer intakten anim zeigenal. Pfeilspitzen weisen auf Standorte wichtig für den Körper Fett Dissektion Protokoll im Text beschrieben.

Abbildung 4. Immuno-Schaltung von genetischen Immunantwort gegen Parasitoiden Angriff. Kern-Komponenten des Toll-Weg gezeigt. Spätzle (SPZ) wird durch die Protease Spätzle Verarbeitung Enzym, SPE aktiviert. Aktivierte Spz dient als Ligand für Toll. Intrazelluläre Signalwege führt zur Aktivierung von NF-kappaB-Transkriptionsfaktoren, Dorsal und Dif. Cactus dient als IKB Inhibitor des Weges. Die Aktivierung von Drosomycin, eine kanonische Toll Weg Zielgen, können überwacht unter Verwendung von transgenen Fliegen-Stämmen mit dem GFP-Reporter (siehe Abb. 6I, J) werden.

Abbildung 5. Encapsulation als Reaktion auf L. victoriae Befall inSerpent> GFP-dl Drosophila Gastgeber. Ein Enhancer in der Schlange Gen wird in Blutzellen ¹³ zum Ausdruck gebracht. Wenn diese Verstärker die Expression des GFP-Dorsal-Fusionsprotein in einem Transgen antreibt, wird Dorsal über die grüne Fluoreszenz von GFP in einigen plasmatocytes und Lamellozyten, aus denen die Kapseln und Aggregate erfaßt. Alle Bilder wurden unter Verwendung eines Zeiss LSM konfokalen Mikroskop. Ein Ei von L. victoriae. BD Lamellozyten (weiße Pfeile) am hinteren Ende des Eies Express GFP-Dorsal. CD Höhere Vergrößerungen der Probe im Feld B EH Die Proben werden mit Rhodamin-markiertem Phalloidin gegengefärbt zu filamentösen Aktin (F-Aktin, rot) zu visualisieren und mit Hoechst 33258 zu visualisieren DNA (blau). E Encapsulated Ei L. victoriae. F melanisierten Kapsel von L. victoriae. GH L. victoriae Infektion induziert Blutkörperchen (plasmatocyte und lamellocyte) Aggregation.

Abbildung 6. Immunantworten gegen Wespen-Infektion. Bilder in Abb. A und B wurden mit einem Zeiss Axio Scope. Bilder in Panels CJ erhalten unter Verwendung eines konfokalen Mikroskop Zeiss LSM wurden. Ein Host-Larve zeigt melanisierten gekapselten Wespe Ei (Pfeilspitze) durch den durchsichtigen Häutchen. B Repräsentative dritten Larvenstadium Larven Lymphdrüse mit Hoechst 33258 gefärbt enthüllt Zellen aller Lappen und durchsetzt perikardialen Zellen. Maßstabsbalken entspricht 100 μ. CJ Alle Proben mit Hoechst 33258 (zur Kennzeichnung von Kernen) und Rhodamin Phalloidin (F-Aktin zu bezeichnen) wurden gegengefärbt. CD Anterior Lymphdrüse Lappen von der Kontrolle (C) und L. victoriae-infizierten (D) MSNF9-GFP Tiere. In infizierten Tieren, MSNF Enhancer Ausdruck, spezifisch für lamellocytes ¹⁴ ist mit einem nuklearen GFP-Reporters nachgewiesen. E Plasmatocytes von nicht infizierten Tieren isoliert nicht exprimieren GFP. Diese Tiere haben sehr wenige oder gar keine Lamellozyten. F Plasmatocytes (GFP-negativ, kurzer Pfeil) und neu-differenzierten, größeren Lamellozyten (lange Pfeile) mit schwachen Kernkraft GFP-Expression von L. victoriae-infizierten MSNF9-GFP-Larve. G Freie und aggregierte plasmatocytes und Lamellozyten aus dem Haemocoel einer L. victoriae-infizierten DRS-GFP-Larve. Die Expression des DRS-GFP-Reporter wird in einigen plasmatocytes (kurzer Pfeil) aktiviert, aber nicht in Lamellozyten (lange Pfeile) nach der Infektion. H verkapselt und melanisierten Wespe Larve von L. MSNF9-GFP Wirtslarve boulardi-infiziert. Zahlreiche MSNF9-GFP-positive lamelloctyes umgeben die Wespe Larve (dunkle Struktur, dicker Pfeil) und zeigen eine starke nukleare GFP-Expression (lange Pfeile). Diese Pfanneel zuvor in PLoS One ¹⁵ veröffentlicht. IJ Fat Körperzellen von nicht infizierten (I) und L. seziert victoriae-infizierten (J) DRS-GFP-Larve. GFP ist nukleäre und zytoplasmatische Fett in die Körperzellen des infizierten Tieren. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 7. Spätzle-Expression nach Infektion Schlupfwespe. AJ Die Proben wurden mit Hoechst 33258 gegengefärbt, um DNA zu visualisieren. Alle Bilder wurden mit einem Zeiss LSM konfokalen Mikroskop. AF Vorderlappen von nicht infizierten Larven yw seziert. Die Proben wurden für indirekte Immunfärbung ohne primären Antikörper verarbeitet (A und B) oder mit Anti-Spz Antikörper (rot, C, D, E, F) und gegengefärbt mit Alexa Mehl-Kopplung an Markierung F-Aktin in Zellen (grün;. B, D, F) GJ Vorderlappen aus infizierten Larven yw und gefärbt mit anti-Spz Antikörper (rot seziert, G, H, I, J) und Alexa Fluor-Phalloidin (grün;. Paneele H, J) EF Höhere Vergrößerungen von Proben in C bzw. D. IJ Höhere Vergrößerungen der Proben in G und H, jeweils. Maßstabsbalken in Platten AD, G, H 50 um.

8. Larven und Puppen Stadien von L. heterotoma und L. boulardi. Einzelne Stufen wurden aus Larven-oder Puppenstadium fly Gastgeber Beitrag Befall isoliert, wie angegeben. Alle Bilder wurden mit einem Zeiss Axio Scope. Obere Reihe AF L. heterotoma Stufen, 1-6 Tage nach der Infektion. Untere Reihe AF postembryonalen L. boulardi Stufen 4 bis 12 Tage nach der Infektion.

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Abbildung 9. Flussdiagramm der experimentellen Protokoll.

Discussion

Das Interesse an Schlupfwespen von Drosophila wird als molekulare Techniken, um ganze Genome entschlüsseln werden effiziente und kostengünstige sprunghaft zu. Jedoch im Verhältnis zu ihrem außergewöhnlich gut untersuchten Gastgeber, bleiben viele faszinierende Aspekte der Biologie Wespe im Dunkeln. Dazu gehören Fragen im Zusammenhang mit Reichweite, Immunsuppression, Superparasitismus und Verhalten zu hosten. Der Schwerpunkt dieser Präsentation war es, die Auswirkungen der Infektion auf der Fliege Immunsystem Gewebe zu demonstrieren. Die Dissektion Techniken demonstriert hier kann für die Analyse der Genexpression auf RNA-Ebene (in-situ-Hybridisierung), oder zur Extraktion von Nukleinsäure für Microarrays oder PCR oder für Western-Analysen von Proteinen verwendet werden. Eine Vielzahl von fly-Stämme sind von den Lager-Zentren und einzelne Forschungslabors zu manipulieren und zu beschriften Immunzellen zur Verfügung. Die Wahl der Fliege-Stämmen wird durch die experimentellen Fragen diktiert. Diese Präparation Techniken können auch für die Analyse des Immunsystems verwendet werdenGewebe von anderen Drosophila-Arten.

Materials

Yeast	Fisher Scientific	S80245-3	Active Dry
Fly Food	Home made	Corn meal, sugar	Standard
Honey	Dutch Gold	From the store	Clover
Vials	Fisher Scientific	AS514
Cotton plug/Foam stopper	Fisher Scientific	14-127-40A
Spatula	Fisher Scientific	21-401-15
Pyrex dissecting dish	Fisher Scientific	50-930-382	9-well
Microscope slides pre-cleaned	Fisher Scientific	7101	25.4 mm x 76.2 mm
Glass coverslips	Pearl	D12544	22 x 50
Glass coverslips	Pearl	G12544	22 x 60
Pasteur Pipette	J H Berge	71-5200-05
100 mm Tweezers	Sigma-Aldrich	T-4662	Style # 5
Wash Bottle	Fisher Scientific	03-409-22A	Fisherbrand
Kim Wipess	Fisher Scientific	34155	Kimberly Clark
Paper Towel	Fisher Scientific	Fisher X-101-C	1/8 x 13 1/8 in.
Leica stereomicroscope	Empire Imaging Systems, INC.	10446208	MZFLIII
Zeiss Stereomicroscope	Carl Zeiss, Inc.	000000-1006-126	"Stemi" 1000 or 2000-C
Light Source -LED Gooseneck illuminator	Fisher Scientific	12563501
Stage	Carl Zeiss, Inc.
Zeiss Laser 510 Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Incubator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	815
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X	Fisher Scientific	MT-21-030-CM Mediatech
Ethanol	Fisher Scientific	64-17-5	99.5 %
Formaldehyde (37% w/w)	Fisher Scientific	F79-1
H–chst 33258	Molecular Probes, Life Technologies	H-1398	0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes, Life Technologies	R415	200 units/ml (6.6 μM) Excitation 546 nm; Emission 565 nm
Alexa Fluor 488 phalloidin	Molecular Probes, Life Technologies	A22289	Excitation 495 nm; Emission 518 nm 300 units/ml
CO<sub>2</sub> tank	TW Smith
Anti-Spz antibody	Gift Dr. C. Hashimoto (Yale)
Secondary antibody TRITC-conjugated donkey anti-rabbit, concentration 1:50.	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	Detected at Excitation 546 nm; Emission 565 nm
Antifade	MP Biomedicals	ICN10274790	0.08 mg of N-propyl gallate in 20 ml of 50% glycerol in 1X PBS
<strong>Wasp Strains</strong>			<strong>Fly Strains</strong>
<em>L. victoriae</em><sup>16</sup>			<em>y w</em>
<em>L. boulardi 17</em><sup>1</sup>			<em>UAS-GFP-Dorsal</em><sup>17</sup>
<em>L. heterotoma</em><sup>2</sup>			<em>SerpentHemoGal4</em><sup>13</sup>
<em>L. heterotoma 14</em><sup>1</sup>			<em>MSNF9-moCherry</em><sup>14</sup>
<em>Trichopria drosophilae </em>			<em>MSNF-GFP</em><sup>15</sup>
<em>G. xanthopoda</em><sup>18</sup>			<em>y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc</em><sup>4</sup>
<em>y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+</em><sup>12</sup>