Labeling Stammzellen mit Ferumoxytol, eine FDA-Zulassung Eisenoxid-Nanopartikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Technik zur Kennzeichnung und Verfolgung von Stammzellen mit FDA-Zulassung, superparamagnetische Eisenoxid (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Diese zellulären bildgebendes Verfahren, das Magnetresonanz-(MR)-Bildgebung nutzt zur Visualisierung, ist leicht zugänglich für die langfristige Überwachung und Diagnose von Erfolg oder Misserfolg Stammzellen engraftments bei Patienten.

Zusammenfassung

Stammzell-basierte Therapien bieten erhebliches Potenzial für den Bereich der regenerativen Medizin. Dennoch bleibt noch viel zu verstehen in Bezug auf die in vivo Kinetik der transplantierten Zellen werden. Eine nicht-invasive Methode, um wiederholt zu überwachen transplantierten Stammzellen in vivo erlauben würde Ermittler direkt zu überwachen Stammzell-Transplantationen und identifizieren erfolgreiche oder erfolglose Transplantation Ergebnisse.

Eine breite Palette von Stammzellen weiterhin für unzählige Anwendungen untersucht werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf 3 verschiedenen Stammzell-Populationen: menschliche embryonale Nierenzellen 293 (HEK293-Zellen), humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). HEK 293 Zellen aus menschlichen embryonalen Nierenzellen in Kultur mit geschert Adenovirus 5 DNA gewachsen abgeleitet. Diese Zellen weit verbreitet sind in der Forschung eingesetzt, weil sie leicht kultiviert werden, wachsen schnell und sind leicht transfiziert. hMSCs sind bei erwachsenen Knochenmark gefunden. Diese Zellen ca.n als undifferenzierte Zellen repliziert werden unter Beibehaltung Multipotenz oder das Potential, in einer begrenzten Anzahl von Zellanlagen unterscheiden. hMSCs können Abstammungslinien von mesenchymalen Geweben, einschließlich Osteoblasten, Adipozyten, Chondrozyten, Sehnen, Muskeln und Knochenmarkstroma unterscheiden. iPS-Zellen sind genetisch adulten Zellen, die modifiziert wurden, um Gene und Faktoren ähnlich definierenden Eigenschaften von embryonalen Stammzellen umprogrammiert auszudrücken. Diese Zellen sind pluripotent dh sie haben die Fähigkeit, sich in allen Zelllinien ¹ unterscheiden. Beide hMSCs und iPS-Zellen haben Tissue Regenerationsfähigkeit in-vivo demonstriert.

Magnetresonanztomographie (MRT) zusammen mit der Verwendung von superparamagnetischen Eisenoxid (SPIO) Nanopartikel-Zell-Labels haben sich für in vivo Verfolgung von Stammzellen aufgrund der Nähe mikroskopischen anatomischen Auflösung effektiv, erlaubt eine längere Blut-Halbwertszeit, die Längs-Bildgebung und die hohe sensitivity für Zell-Erkennung durch MR-Bildgebung von SPIO sofern Nanopartikel ^2-4. Darüber hinaus ist der MR-Bildgebung mit dem Einsatz von SPIOs klinisch übersetzbar. SPIOs eines Eisenoxid-Kern mit einer Dextran, Carboxydextran oder Stärke Oberflächenbeschichtung, die den bioreaktiven Eisenkern aus dem Plasma-Komponenten enthalten dient zusammen. Diese Mittel schaffen lokale Magnetfeldinhomogenitäten, die zu einem verringerten Signal auf T2-gewichteten MRT-Bilder zeigen ⁵ führen. Leider sind SPIOs nicht mehr hergestellt. Zweite Generation, ultrakleinen SPIOs (USPIO), bieten jedoch eine gute Alternative. Ferumoxytol (FerahemeTM) ist eine USPIO einer nicht-stöchiometrischen Magnetit Kern durch eine Polyglucose Sorbit carboxymethylether Mantel umgeben sind. Die kolloidalen, Partikelgröße von ferumoxytol ist 17-30 nm durch Lichtstreuung bestimmt. Das Molekulargewicht beträgt 750 kDa, und die Relaxivität konstant bei 2T MRI Feld ist 58,609 mM-1 sec-1 Stärke ^4. Ferumoxytol wurde vor kurzem von der FDA genehmigte eines ein Eisenpräparat zur Behandlung von Eisenmangel bei Patienten mit Nierenversagen ^6. Unsere Gruppe hat dieses Mittel in einer "off label" Einsatz für die Zell-Kennzeichnung Anwendungen eingesetzt. Unsere Technik demonstriert eine effiziente Markierung von Stammzellen mit ferumoxytol, die zu erheblichen MR-Signal Auswirkungen der markierten Zellen auf MR-Bildern führt. Diese Technik kann für nicht-invasive Überwachung der Stammzelltherapie in der vorklinischen und klinischen Umgebungen eingesetzt werden.

Protokoll

1. Tag 1

1) Platte Zellen

1. Platte hMSC in einer T75-Kolben bei einer Konfluenz von 80% mindestens 18-24 Stunden vor der Markierung. Siehe Tabelle 1 für den Unterricht für alternative Fahrzeuge.

2. Tag 2

2) Bereiten Kennzeichnung Lösung. Diese Vorbereitung wird eine (1) T75-Kolben bei 80% Konfluenz mit einer Konzentration von 400 ug Fe / ml Etikett. Siehe Tabelle 1 für den Unterricht für alternative Fahrzeuge.

1. Erstellen Sie eine Lösung (Lösung 1) durch Mischen von 1 ml Serum-freien Medien und 93,1 ul ferumoxytol (Bestand: 30 mg / ml) in einem 15 ml konischen Röh....

Diskussion

Verbesserung der Wirksamkeit von Stammzellen engraftments ist entscheidend für die Weiterentwicklung der regenerativen Medizin. Eine nicht-invasive Visualisierung Technik für Stammzellen in vivo signifikant verbessert unsere Fähigkeit, Mechanismen, die eine erfolgreiche Transplantation Ergebnissen führen verstehen. Magnetische Kennzeichnung für MR-Visualisierung, wie das Verfahren, das wir gezeigt haben, können in vivo Verfolgung von Stammzellen mit der MR-Bildgebung. Magnetisch markierte Stammzellen h.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
D-MEM Hohe Glucose	Sigma	D5648	Oder andere Basismedium für die gewünschte Stammzelllinie verwendet werden
D-PBS (Ca + +, Mg + + frei)	GIBCO	14190-144
Trypsin-EDTA 0,05%	Invitrogen	25300-120
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Ferumoxytol (Feraheme)	AMAG	59338-0775-01
Protaminsulfat	APP Pharm.	22930