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Propagierung und Erkennen einer ansteckenden Molecular Clone von Maedi-Visna Virus, das Green Fluorescent Protein exprimiert

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DOI:

10.3791/3483

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9. Oktober 2011

 , 
1Institute for Experimental Pathology, University of Iceland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen molekularen Klon des Maedi-Visna Virus, das GFP exprimiert und ist voll ansteckend. Die Replikation von diesem Virus kann durch die Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen werden.

Zusammenfassung

Maedi-Visna Virus (MVV) ist ein Lentivirus von Schafen, was langsam fortschreitende interstitielle Pneumonie und Enzephalitis 1. Die primären Zielzellen von MVV in vivo gelten als der Monozyten-Linie 2 sein. Bestimmte Stämme von MVV können in andere Zelltypen zu replizieren, jedoch 3,4. Das grün fluoreszierende Protein ist ein häufig verwendeter Marker für die Untersuchung Lentiviren in lebenden Zellen. Wir haben die EGFP-Gen in das Gen für dUTPase der MVV eingefügt. Die dUTPase Gen ist in den meisten Lentivirus Stämme von Schafen und Ziegen erhalten und hat sich gezeigt, dass bei der Replikation von CAEV 5 wichtige. Allerdings hat dUTPase konnte gezeigt werden, entbehrlich für die Replikation des molekularen Klon des MVV in dieser Studie sowohl in vitro und in vivo 6 verwendet. MVV-Replikation ist streng auf Zellen von Schafen oder Ziegen Herkunft beschränkt. Wir verwenden eine primäre Zelllinie, die aus dem Plexus von Schafen (SCP-Zellen) für die Transfektion und Vermehrung der Virus 7. Die fluoreszierenden MVV ist voll Infektions-und EGFP-Expression über mindestens 6 Durchgänge 8 stabil. Es ist eine gute Korrelation zwischen den Messungen der TCID 50 und EGFP. Dieses Virus ist daher sinnvoll sein, für die schnelle Erkennung von infizierten Zellen in Studien Zelltropismus und Pathogenität in vitro und in vivo 8.

Protokoll

1. Transfektion

Die molekulare Klon ist in zwei Plasmiden, p8XSp5-EGFP und p67r, von 12 kb und 4,5 kb bzw. enthalten. 9,10

  1. Cut äquimolaren Mengen der beiden Plasmide, dh 4,4 pg p8XSp5-eGFP und 1,6 ug p67r mit XbaI und ligieren vor der Transfektion.
  2. Für die Ligation, verwenden Sie 1 Weiss Einheit Ligase in einem 50 ul Reaktions-und Inkubieren bei 16 ° C über Nacht.
  3. Wenn Ligation abgeschlossen ist, inkubieren Ligationsmix bei 65 ° C für 15 min zur Inaktivierung der Ligase. Dieser Schritt kann weggelassen werden.
  4. Zwei Tage vor der Transfektion, Saatgut 10 6 SCP Zellen in einer T25 Zellkulturflasche und wachsen Zellen für zwei Tage in 5 ml DMEM + 10% Lamm Serum und 2 mM Glutamin, ohne Antibiotika, um eine Monoschicht von 90% Konfluenz. Wenn die Zellen nicht 90% Konfluenz nach zwei Tagen erreicht, lassen die Zellen wachsen einem zusätzlichen Tag.

Hinweis: Das Lamm Serum kann durch fötales Rinderserum (FBS) ersetzt werden. Wir verwenden routinemäßig Lamm Serum, da einige Stämme von MVV von FBS sind gesperrt; dieser MVV Stamm ist nicht gehemmt durch FBS jedoch.

  1. Wenn die Zellen bereit für die Transfektion sind, ändern Sie mittel-bis DMEM mit 1% Serum (Lamm Serum oder FBS) ohne Antibiotika.
    Wir verwenden Lipofectamin 2000 (Invitrogen) für die Transfektion.
  2. Verdünnen Sie die DNA in 500μl Opti-MEM-Medium.
  3. Verdünnen Sie 20 &mgr; l Lipofectamin 2000 in 500μl Opti-MEM-Medium und lassen bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
  4. Nach dem 5 min Inkubation, kombinieren die verdünnte DNA mit verdünnter Lipofectamine 2000 (Gesamtvolumen = 1000 ul). Vorsichtig mischen und inkubieren für 20-30 min bei RT.
  5. Fügen Sie die Transfektion Mix (1 ml) der T25 Kolben mit SCP Zellen und Medium (5 ml). Mix von rocking sanft.
  6. Bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht (18 bis 24 h).
  7. Ändern Medium am folgenden Tag um DMEM mit 1% Serum, 2 mM Glutamin, Penicillin und 100IU 100IU Streptomycin.
  8. Überwachen der Herstellung von GFP in der SCP-Zellen durch invertierte Fluoreszenz-Mikroskopie. 15% - Niedrige Transfektionseffizienz können mit diesen primären Zellen, in der Regel 5 zu erwarten.
  9. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für mehrere Tage, damit die Verbreitung des Virus in den Kolben. Es dauert in der Regel 7-14 Tage für volle Infektion.
  10. Ernte des Virus durch Aliquotierung der Überstand in Eppendorf-Röhrchen. Spin in einer Mikrozentrifuge bei 3000 rpm für 5 min um Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand mit dem Virus auf neue Röhren. Lagerung bei -80 ° C.

2. Titration von Viren

  1. Seed 3x10 4 SCP-Zellen in 100 ul DMEM Medium mit 10% Serum, 2 mM Glutamin, Penicillin und 100IU/ml 100IU/ml Streptomycin pro Well in einer 96-Well-Platte ergänzt. Bei 37 ° C, 5% CO 2.
  2. Wenn die Zellen konfluent sind am folgenden Tag, ändern mittel-bis DMEM mit 1% Serum, 2 mM Glutamin, Penicillin und 100IU/ml 100IU/ml Streptomycin, 100 ul in jede Vertiefung.
  3. Verdünnen Sie das Virus in folgender Weise:
    1. Add 180 ul DMEM mit 1% Serum, 2 mM Glutamin, Penicillin und 100IU/ml 100IU/ml Streptomycin pro Vertiefung zu 4 x 10 Wells in einer 96-Well-Rundboden-oder V-Bodenplatte.
    2. Für die serielle Zehnfachverdünnungen in vierfacher Ausfertigung, mit 20 ul des Virus auf jeden 4wells in der ersten Spalte der Platte, und mit einem Vier-Kanal-Pipette Pipette auf und ab, um sicherzustellen, dass die Proben gründlich gemischt werden. Ändern Pipettenspitzen und Transfer 20 pl auf die nächsten 4 Brunnen und so weiter. Lassen Sie die letzten Brunnen ohne Virus für eine negative Kontrolle.
  4. 100 l des Virus Verdünnungen der SCP-Zellen und Medium.
  5. Bei 37 ° C und 5% CO 2. Beachten Sie für die GFP-Fluoreszenz und zytopathischen Effekte für zwei Wochen.
    Zytopathischen Effekte bestehen aus Zellen immer gerundet und weniger transparent als normale Zellen mit Prozessen ausstreckt, endend mit mehrkernigen Zellen erscheinen und Zelltod.
  6. Berechnen Virustiter (TCID50) mit der Reed Muench-Methode 11.

3. FACS-Analyse von infizierten Zellen

Hinweis: Für die schnelle Kontrolle der Replikation des Virus, infizierten Zellen können mittels Durchflusszytometrie untersucht werden.

  1. Trypsinize infizierten Zellen (ca. 10 5), waschen 1x mit PBS und Resuspendieren in 500μl PBS.
  2. Add 500 ul 4% Paraformaldehyd-Lösung (2% Endkonzentration) bei RT für 30 min inkubieren.
  3. Pellet-Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 3000 rpm für 5 min.
  4. Waschen mit PBS 2x5 min und zu analysieren, auf einem FACScan-Analysator. Count 10.000 Veranstaltungen.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Dieser Virus sollte voll ansteckender und zu replizieren, um einen Titer von 10. Juni - 10 Juli TCID 50 / ml. Infizierte Zellen werden Fluoreszenz und kann det werdenected mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. In der Regel können GFP in mehr als 60% der Zellen in die infizierten Zellkulturen mittels Durchflusszytometrie (Abb. 1) festgestellt werden. Ebenso, wenn visualisiert durch Fluoreszenz-Mikroskopie, sind ein Großteil der Zellen fluoreszierende (Abb. 2A und B).

Abbildung 1
Abbildung 1. FACScan Analyse der SCP-Zellen mit KV1772-eGFP Viren nach 7 Tagen der Infektion infiziert.

Abbildung 2
Abbildung 2. Phasenkontrast-Mikroskopie von SCP-Zellen mit KV1772-egfp nach 7 Tagen Inkubation (A) infiziert. Gleiche Zellen visualisiert mittels Fluoreszenzmikroskopie (B).

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Diskussion

Die GFP-exprimierenden molekularen Klon des MVV hier vorgestellten sollte für die Analyse der Host-Zell-Interaktionen und Pathogenität von MVV sowohl in vitro und in vivo. Das Virus nach 7-14 Tagen der Replikation erhalten hat zweifellos einige Mutationen aufgrund der Ungenauigkeit der reversen Transkriptase erworben. Allerdings gibt es Einschränkungen bei der Verwendung dieser Klon als Single-Cycle-Vektor. Einer ist, dass die Verwendung der Klon-Zellen von Schafen und Ziegen Herkunft beschränkt ist. Die Transfektionsef...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der isländischen Research Fund und der Universität von Island Research Fund gefördert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer
DMEM Gibco 10938025
Opti-MEM Gibco 51985018
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019

Referenzen

  1. Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).
  2. Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes. J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).
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  4. Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence. Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).
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Schlagwörter

Schaf Choroid Plexus ZellenFluoreszenzmikroskopieDurchflusszytometrieViruslast AssayTCID50 MessungPlasmid TransfektionViruspropagationzytopathische Effekte

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