Dies ist ein Protokoll, um aktiv in voller Länge zu isolieren Kinesin aus Drosophila Embryonen für die Einzel-Molekül-biophysikalische Untersuchungen. Wir zeigen, wie man Embryonen zu sammeln, machen den Embryo-Lysat, und dann polymerisieren Mikrotubuli (MT). Kinesin ist durch Immobilisierung auf der MTS, Spinning Festlegung der Kinesin-MT-Komplexe, und dann die Freigabe der Kinesin aus dem MTS via ATP zusätzlich gereinigt.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Motorproteine bewegen Ladungen entlang von Mikrotubuli, und transportieren sie zu spezifischen subzellulären Orten. Aufgrund veränderter Transport wird vorgeschlagen, eine Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde liegen, verstehen Mikrotubuli beruht Kraftverkehrs und dessen Regulierung dürfte letztlich zu einer verbesserten therapeutischen Ansätzen führen. Kinesin-1 ist ein Motor eukaryotischen Protein, das in eine anterograde (Plus-Ende) entlang Mikrotubuli (MT), durch ATP-Hydrolyse bereitgestellt bewegt. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zur aktiven Reinigung voller Länge Kinesin von Drosophila-Embryonen zu isolieren, so dass die Kombination von Drosophila-Genetik mit Einzel-Molekül-biophysikalische Untersuchungen. Beginnend mit ca. 50 Tassen legen, mit etwa 1000 Frauen pro Tasse, haben wir über Nacht Sammlungen. Dies lieferte ungefähr 10 ml gepacktes Embryonen. Die Embryonen waren Bleichmittel dechorionated (was ungefähr 9 Gramm Embryonen), und dann homogenisiert. After Störungen, wurde das Homogenat geklärt mit einer langsam laufenden Spin durch eine Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation. Der geklärte Überstand wurde mit GTP und Taxol behandelt, um MTs zu polymerisieren. Kinesin wurde auf polymerisierten MTs mit indem die ATP-Analogon, 5'-Adenylat Imidodiphosphat bei Zimmertemperatur immobilisiert. Nach Kinesin bindend, wurden Mikrotubuli über Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation durch ein Saccharose-Kissen sedimentiert. Die Mikrotubuli Pellet wurde dann erneut suspendiert, und dieses Verfahren wurde wiederholt. Schließlich wurde hinzugefügt, um die ATP-Kinesin aus dem MTs freizugeben. Hochgeschwindigkeitszentrifugation dann abzentrifugiert der MTS, dem Verlassen des Kinesin im Überstand. Diese Kinesin einer zentrifugalen Filtration mit einem 100 KD-Sperrfilter für die weitere Reinigung unterzogen wurde, aliquotiert, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80 ° C SDS-Gelelektrophorese und Western Blotting wurde unter Verwendung des gereinigten Probe. Die motorische Aktivität der gereinigten Proben vor und nach dem letzten Schritt Zentrifugalfiltrationwurde unter Verwendung eines in vitro-Assay einzelnes Molekül Mikrotubuli. Die Kinesin Fraktionen vor und nach der Zentrifugalfiltration zeigten Prozessivität wie zuvor in der Literatur berichtet. Weitere Versuche sind im Gange, um die Interaktion zwischen Kinesin und anderen Verkehrsmitteln verwandten Proteinen zu evaluieren.
Protokoll
Stämme von Fliegen können gekauft werden und verstärkt im Labor. Je nach der Menge von Drosophila Kultur Fläschchen erhalten, braucht man zu häufig "umkippen" die Kultur Fläschchen, Ampullen, sobald die maximale Kapazität erreicht hat. Die Verstärkung wird fortgesetzt, bis etwa 50 Drosophila Kultur Fläschchen gefüllt sind. Man macht dann "fliegen cups 'mit 100 ml Becher Dreispitz (Fly Cup Herstellung wird im nächsten Abschnitt). Nach 24 Stunden verwenden Embryonen aus diesen Bechern zu Saatgut neue Drosophila Kultur Fläschchen mit aufgeklebten Fliege Nahrung am Boden. Bei Raumtemperatur sind die Wachstumszeit für Drosophila-Embryonen
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Rinderhirn ist das am häufigsten verwendete Ausgangsmaterial 11 bis voller Länge Kinesin zu reinigen, wenn murine Gehirn und 12 verwendet wurden. Ein großer Nachteil der Verwendung von Rinder-Hirn als Kinesin-Quelle ist die Verfügbarkeit von frischem Ausgangsmaterial: Schlachthöfe sind in der Regel nicht zugänglich, und das Gehirn muss sehr frisch, um aktiv Kinesin zu erhalten. Weiterhin sind nur die Gehirne der jungen Kühe wirksam. Schließlich ist Genmanipulation von Kühen zur Zeit keine gangbare .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Besonderen Dank an Kris Ngai und Jason Del Rio für ihre Unterstützung und Hilfe in diesem Projekt. Diese Arbeit wurde von RO1 Zuschuss zu GM070676 SPG unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes oder Material | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| Agar (granuliert) | Fischer | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Wasserfreies | Fischer | D16-3 | |
| Petrischalen | Becton | 35 1007 | 60x15mm Stil (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Fläschchen | UCI | ||
| Tricorn Becherglas | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volumen: 100 ml, Größe: 58x72mm |
| Hefe | Red Star | 2751 | |
| Nylon-Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 mIcron Porengröße |
| Nylon-Mesh | Kleinteile | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerin | Fischer | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS0 4 (wasserfrei) | Fischer | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP-Analogon 5'-Adenylat Imidodiphosphat | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra-Zentrifugalmühle Filter: 0,5 mL, 100 kD abgeschnitten, 8 Stück | Millipore | UFC510008 |
Referenzen
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
