Ganze Tier Perfusionsfixierung für Nager

1. Bereiten Sie Fixativ

(Siehe Tabelle Fixativ und Puffer.)

2. Bereiten Perfusion Puffer

(Siehe Tabelle Fixativ und Puffer.)

3. Bereiten Apparate-und Anästhesie

1. Mit dem Wasserbad warm Perfusionspuffer bis 37 ° C. Auslaßventil Platz in einem Becherglas mit Puffer gefüllt. Füllen Sie eine 50 ml Spritze mit Puffer und heften sich an Fixativ Schlauch. Flush Schlauch wiederholt durch Austreiben und Aberkennung der Puffer.
2. Deaktivieren der Linie mit Puffer, bis alle Luftblasen in dem Schlauch entfernt sind. Es ist entscheidend für den Erfolg eines Perfusion um keine Luftblasen zu einem der Linien haben.
3. Entfernen Sie die Spritze und schließen Sie die 4% Paraformaldehyd-Fixativ (Raumtemperatur) Behälter. Um Luftblasen am Rohrende zu vermeiden, drücken das Rohr während der Positionierung des Rohrs in den Behälter, so dass ein Tropfen Puffer von dem Ende to an der Oberfläche der Flüssigkeit in dem Behälter.
4. Schließen der Auslaßöffnung (Nadelende). Drehen Puffer Ventil (blau) auf der gleichen Position wie das Fixiermittel Ventil (weiß). Dies ermöglicht Flow aus dem Puffer Linie nur.
5. Öffnen Sie die Auslassöffnung und wiederholen Sie Schritt A1 bis A3 zum Füllen des Puffers Linie. Nachdem alle Luftblasen nahe der Auslassöffnung eliminiert werden, entfernen Sie die Spritze und verbinden Sie den Pufferbehälter, dabei nicht um Luftblasen in den Schlauch einführen.
6. Testsystem zur Fähigkeit, Druck durch Pumpen mit der Gummi-Manometer blub halten. Es ist normalerweise ein Widerstand durch die Kompression der Luft in dem System.
7. Richten Chirurgie Werkzeuge, damit leicht zugänglich. Füllen Perfusion Nadel mit Puffer, um die Möglichkeit von Luftblasen zu beseitigen.
8. Vor der Operation wird ein Ketamin / Xylazin-Mischung (bis zu 80 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin) durch intraperitoneale Injektion (27 Gauge Nadel und 1 ml-Spritze) verabreicht. Zusätzliche der Anästhesie falls erforderlich, wird im Verlauf jeder Operation, um ein chirurgisches Ebene Anästhesie beizubehalten durchgeführt werden.

4. Perfusion Chirurgie

1. Sobald das Tier einen chirurgischen Ebene der Anästhesie erreicht hat, setzt sie auf die flache Schale mit Crushed Ice gefüllt. (Verwenden Sie Zeh Pinch-Response-Verfahren, um Narkosetiefe zu bestimmen. Tier darf nicht ansprechbar sein, bevor Sie fortfahren).
2. Machen Sie eine 5-6 cm seitlichen Schnitt durch die Haut und Bauchdecke direkt unter dem Brustkorb. Sie vorsichtig die Leber von der Membran.
3. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Membran mit den gebogenen, stumpfen Schere. Die Position und der Druck des dem Finger in der Fähigkeit, um die Membran geschnitten zu unterstützen.
4. Fahren Sie mit der Membran Einschnitt über die gesamte Länge des Brustkorbs, um die Pleurahöhle aussetzen.
5. Legen gebogen, stumpf Scheren entlang einer Seite der Rippen, sorgfältig Verschieben der Lunge, und einen cut durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der Gegenseite.
6. Heben Sie das Brustbein entfernt, schneiden Sie aufmerksam alle Gewebe Anschluss an das Herz. Klemmen Sie die Spitze des Brustbeins mit der Blutstillung und platzieren Sie den Gefäßklemme über den Kopf. Wenn man es richtig macht, hebt die Thymusdrüse entfernt vom Herzen zusammen mit dem Brustbein und bietet einen freien Blick auf den großen Schiffen.
7. Einen kleinen Schnitt mit dem hinteren Ende des linken Ventrikels mit Iris Schere.

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8. Übergeben Sie eine 15-Gauge-stumpf-oder Olivenöl-bestückte Perfusion Nadel durch den Schnitt Herzkammer in die Aorta ascendens. Die Spitze sichtbar sein soll durch die Wand der Aorta, und sollte nicht erreichen den Aortenbogen, wo die Arm-und Halsschlagadern divergieren.
9. Mit einer Klemme, um das Herz zu klemmen, sichert dies die Nadel und ein Auslaufen verhindert. Falls gewünscht, kann das modifizierte Gefäßklemme verwendet, um die Aorta um die Nadelspitze Klemme (diese Hämostaten werden bis zum Dissektion beginnt, wird aber von künftigen Abbildungen aus Gründen der Klarheit weggelassen werden).
10. Schließlich einen Einschnitt machen, um das Tier rechten Vorhof mit Iris-Schere, um so groß wie möglich einen Ausgang ohne Beschädigung der absteigenden Aorta zu schaffen. An diesem Punkt ist das Tier bereit, perfundiert werden.

5. Perfusion

1. Öffnen und schließen Auslassöffnung zu Nadelgrundteils kümmert sich nicht um mögliche Luftblasen einzuführen.
2. Pump up the Manometer Glühbirne zu einem Druck von 80 mm Hg schnell & gleichmäßig. Halten Sie diesen Druck während der Puffer Infusionsdauer. Starten Sie den Timer.
3. Passen Sie die Nadel Winkel. Der Winkel der Nadel ist entscheidend für die Erreichung eines maximalen Durchfluss (man beachte die Strömung Veränderung mit Winkelverstellung).
4. Schalten Sie den Buffer Ventil (blau), wenn Puffer ist fast fertig (200 ml). Die Flüssigkeit sollte ausgeführt werden, klar. Die Räumung der Leber ist ein Indikator für eine gute Durchblutung. Die Leber sollte an dieser Stelle klar. Geben Sie Zeit für Ihre Unterlagen.
5. Fixation Zittern sollte innerhalb von Sekunden beobachtet werden, dies sollte in Betracht gezogen der wahre Zeitpunkt der Fixierung werden. Geben Sie Zeit für Ihre Unterlagen.
6. Der Druck kann schrittweise auf bis zu einem Maximum von 130 mm Hg ^2, um eine konstante Durchflussrate zu halten.
7. Schließen Sie das Auslassventil einmal das Fixativ fast fertig ist. Geben Sie die Endzeit für Ihre Unterlagen.
8. Die Ratte sollte in dieser Phase steif.
9. Das verwendete Paraformaldehyd müssen gesammelt und zur Entsorgung gelagert werden gemäß den Vorschriften Ihrer Institution.

6. Dissection ^4,11

1. Nehmen Sie den Kopf mit einer Schere.
2. Machen Sie einen Einschnitt an der Mittellinie entlang der Haut vom Hals bis zur Nase und setzen dieSchädel.
3. Schneiden Sie die verbleibenden Nackenmuskulatur so dass die Basis des Schädels freigelegt wird; entfernen Restmuskelfunktionen mit Schere oder Rongeure.
4. Platzieren Sie das spitze Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum auf der einen Seite, sorgfältig Verschieben der Schere entlang der Innenfläche des Schädels.
5. Als nächstes erstellen Sie ein Schnitt Verlängerung bis zum äußeren Rand des hinteren Schädel Oberfläche. Machen Sie einen identischen Schnitt auf der Gegenseite. Verwenden Sie die Rongeure dem Weg zu räumen um den Schädel des Kleinhirns.
6. Vorsichtig die Schere entlang der inneren Oberfläche des Schädels, während die Spitze bewegt sich von der dorsalen distalen hinteren Ecke des distalen Vorderkante des Schädels, Anheben der Schaufel, wie Sie schneiden, um eine Beschädigung des Gehirns zu verhindern. Der gegenüberliegenden Seite wiederholen.
7. Mit Rongeure peel der dorsalen Oberfläche des Schädels entfernt vom Gehirn. Schneiden Sie die Seiten des Schädels mit Rongeure ebenso.
8. Mit einem Spatel, trennen Sie die Riechkolben und nervöse Verbindunggen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns.
9. Sie vorsichtig in das Gehirn vom Kopf weg, Trimmen jedes Dura noch verbindet das Gehirn mit dem Schädel mittels Blende Schere.
10. Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in einem Fläschchen von Fixativ haltigen Flüssigkeit mindestens 10x das Volumen des Gehirns selber. Schwenken Sie die Durchstechflasche gelegentlich.

7. Post-Fixierung und Lagerung

1. Halten Sie das Gehirn in Fixierungsmittel für 24 Stunden bei 4 ° C, gelegentlich wirbeln.
2. Nach 24 Stunden Waschen des Gehirns mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung durch den Austausch der Medien 3 Mal und Verwirbelung jeweils.
3. Gehirne können dann in Phosphat-gepufferter Salzlösung aufbewahrt werden oder HBHS mit Natriumazid und bei 4 ° C

8. Repräsentative Ergebnisse

Ein erster Indikator für den Erfolg der Perfusion ist die Rodung von Extremitäten wie Nase, Ohren und Pfoten und innere Organe wie der Thymusdrüse und der Leber (IHC World).Gross Inspektion des Gehirns zeigt das Blutgefäß Leere des Blutes (weiße bis hellgelbe Aussehen). Das wird auch in Gewebeschnitten Destine für die Färbung und Immunhistochemie wahr. Der letzte Indikator des Ergebnisses der Perfusion ist der Zustand der Ultrastruktur im Gewebe. ^1,6,7,8

Tabelle 1. Vorbereitung der Fixierlösung und Puffer.

Abbildung 1.

Abbildung 2. Vorbereitung des Perfusionsapparatur I. mit dem Fixativ Zeile beginnen. Spülen Sie den Schlauch von Luftblasen und füllen mit Puffer durch schnelles Austreiben und Aberkennung der Puffer in die Spritze und durch die Leitung. Schließen Sie das Ventil auf der Nadel Ende aus. Legen Sie die Leitung in den Fixativ Fixativ Flasche ohne Einbringen von Luftblasen.

3. Herstellung der Vorrichtung Perfusion II. 1. Ventil öffnen auf dem Nadelende. 2. Schalten Puffer Ventil (blau) bis zum Fluss zu positionieren. 3. Spülen Sie den Schlauch von Luftblasen und füllen mit Puffer durch schnelles Austreiben und Aberkennung der Puffer mit der Spritze. 4. Ventil schließen auf dem Nadelende. Setzen Sie das Rohr in die Flasche Puffer. Prüfdruck um sicherzustellen, dass das System versiegelt ist richtigly durch das Aufpumpen des Manometer Glühbirne und beobachtete die Spurweite. Die Vorrichtung ist jetzt bereit für die Perfusion.

4. Perfusion Vorrichtung in Position für den Puffer Lieferung.

Abbildung 5. Perfusion Chirurgie I. a) Machen Sie einen seitlichen Schnitt durch die Haut und Bauchwand. b) Einen Einschnitt in der Membran geschnitten und an der Membran Aussetzen des Herzens. Machen parallele Schnitte auf beiden Seiten der Rippen bis zum Schlüsselbein. c) klemmen die Spitze des Brustbeins mit der Blutstillung und platzieren Sie den Gefäßklemme über den Kopf.

Abbildung 6. Perfusion Chirurgie II. a) Führen Sie die Nadel durch die Perfusion Schnitt Herzkammer in die Aorta ascendens. b) Sichern Sie diePerfusion Nadel Verwendung eines Satzes von Hämostaten, um das Herz zu klemmen. Ein zweiter Satz von einem modifizierten Gefäßklemme kann auch verwendet werden, um die Aorta um die Nadelspitze um ein Auslaufen verhindert festzuklemmen. Mit Iris Schere einen kleinen Einschnitt zu dem hinteren Ende des linken Ventrikels.

Abbildung 7. Perfusion mit Pufferpumpe das Manometer Glühbirne zu Druck in der Leitung zu schaffen. Öffnen Sie das Ventil (1) und heften sich an der Nadel-Hub. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeführt werden. Pump up the Manometer Glühbirne zu einem Druck von 80 mm Hg und pflegen diesen Druck während der Puffer Infusionsdauer.

Abbildung 8. Perfusion mit Fixativ Sobald Puffer ist fast fertig (200 ml) schalten Sie den Puffer Ventil (1), um für das Fixativ fließen zu lassen. Der Druck kann allmählich bis zu einem erhöht werdenmaximal 130 mm Hg beträgt.

Abbildung 9. Dissection I. a) entfernen Sie den Kopf mit einem Paar Scheren. b) Einen Einschnitt in der Haut entlang der Mittellinie vom Hals bis zur Nase und setzen den Schädel. c) schneiden Sie die restlichen Nackenmuskulatur so dass die Basis des Schädels ausgesetzt ist. Halten Sie den Kopf, so dass die große Öffnung in der Schädeldecke Oberfläche (Foramen magnum) zugänglich ist. Schieben Sie das spitze Ende eines Paares von Iris Schere in das Foramen magnum und machen einen Schnitt. Wiederholen Sie das gleiche Manöver für die Gegenseite. Verwenden Sie die Rongeure dem Weg zu räumen um den Schädel des Kleinhirns.

Abbildung 10. Dissection II. a) Schieben Sie die Schere entlang der Innenfläche des Schädels. Heben Sie an der Spitze, wie Sie schneiden, um Schäden am Gehirn zu verhindern. Wiederholen Sie das gleiche fürgegenüberliegenden Seite. Verwenden Sie Rongeure schälen dem Schädel entfernt vom Gehirn. b) Illustration mit dem Schädel entfernt und das Gehirn ausgesetzt. c) Mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen an der vordersten Stelle des Gehirns zu trennen. Führen Sie das Spatelspitze entlang der Unterseite des Gehirns, um Verbindungen zu erleichtern entfernen zu trennen. Entfernen Sie das Gehirn und legen es in das Fläschchen mit Fixativ.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.