Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur chick E4 statoacoustic Ganglion und E6 Rückenmark Explantate. Explantate unter serumfreien Bedingungen in 3D-Kollagen-Gele für 24 Stunden kultiviert. Neuriten Reaktionsfähigkeit ist mit Wachstumsfaktor-ergänzt mittel-und mit Protein-beschichteten Beads getestet.
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Methodenartikel
Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Sinnesorgane des Huhns Innenohr werden durch die peripheren Prozesse statoacoustic Ganglion (SAG) Neuronen innerviert. Sinnesorgan Innervation beruht auf einer Kombination von Axon Führung Signale 1 und Überlebensfaktoren 2 entlang der Flugbahn der wachsenden Axone und / oder in ihren Sinnesorgan Ziele entfernt. Zum Beispiel erzeugt funktionelle Störungen mit einem klassischen Axon Führung Signalweg, Semaphorin-Neuropilin, Fehlleitung von otic Axone 3. Auch mehrere Wachstumsfaktoren in den sensorischen Ziele des Innenohrs, darunter Neurotrophin-3 (NT-3) und Brain Derived neurotrophen Faktor (BDNF), ausgedrückt in transgene Tiere manipuliert worden, was wiederum zu der SAG Axone 4 Fehlleitung. Dieselben Moleküle fördern sowohl das Überleben und die Neuritenwachstum chick SAG Neuronen in vitro 5,6.
Hier beschreiben wir und zeigen die In-vitro-Methode, die wir derzeit usingen, um die Reaktionsfähigkeit von chick SAG Neuriten, lösliche Proteine, einschließlich bekannter Morphogene wie die Wnts, sowie Wachstumsfaktoren, die wichtig für die Förderung der SAG Neuritenwachstum und Neuron Überleben zu testen. Mit diesem Modellsystem, hoffen wir Rückschlüsse auf die Effekte, die sezernierte Liganden auf SAG Neuron Überleben und Neuritenwachstum ausüben kann zeichnen.
SAG Explantate an embryonalen Tag 4 (E4) präpariert und kultiviert im dreidimensionalen Kollagen-Gelen unter serumfreien Bedingungen für 24 Stunden. Erstens ist Neuriten Reaktionsfähigkeit durch Kultivierung Explantate mit Protein-ergänzt Medium getestet. Dann, um zu fragen, ob Punktquellen von sekretierten Liganden können direktionale Effekte auf Neuritenwachstum haben, sind Explantate mit Protein-beschichteten Beads co-kultiviert und untersucht für die Fähigkeit der Raupe vor Ort zu fördern oder hemmen Auswuchs. Wir berücksichtigen auch eine Demonstration der Dissektion (modifizierten Protokoll 7) und die Kultur der E6 Rückenmark Explantate. Wirroutinemäßig Rückenmark Explantate auf Bioaktivität der Proteine und Protein-getränkte Perlen zu bestätigen, und um zu überprüfen Spezies Kreuzreaktivität mit chick Gewebe, unter den gleichen Kulturbedingungen wie SAG Explantate. Diese in-vitro-Assays sind für das schnelle Screening nach Molekülen, die trophische (Überlebensrate) oder tropic (Richt-) Wirkungen auf SAG Neuronen ausüben, insbesondere vor der Durchführung von Studien in vivo bequem. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Prüfung von einzelnen Molekülen unter serumfreien Bedingungen mit hoher Neuron Überleben 8.
Protokoll
Rezepte
Küken Ringers
| 7,2 g | NaCl |
| 0,23 g | CaCl 2 + 2H 2 O |
| 0,37 g | KCl |
| 0,115 g | Na 2 HPO 4 |
| 900 ml | Water (Tissue culture grade) |
Hinweis: Der pH-Wert auf 7,4. Bringen Endvolumen von 1000 ml mit Wasser.
10X PBS
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 g | Na 2 HPO 4 |
| 1,2 g | KH 2 PO 4 |
| 450 ml | DEPC-Wasser |
Hinweis: Der pH-Wert auf 7,4. Bringen endgültigenVolumen auf 500 ml mit Wasser. Arbeitskonzentration (1X) wird durch Verdünnen von 1 Teil 10X Lager mit 9 Teilen von Gewebe-Kultur-Wasser, wie es mit einem Millipore UV-Bestrahlung, um Wasser mit 18 MOhm-cm Leitfähigkeit erzeugen gewonnen wird.
SAG Explantation halten Medium
- DMEM/F12 mit L-Glutamin, 10 mM Hepes
- 10% Insulin, Übertragen, Selenium (ITS +1)
- 1% Pen-Strep
Explantation Kulturmedium
- SAG Explantation halten Medium
- 10 ng / ml Neurotrophin-3 (NT-3)
- 10 ng / ml ciliary neurotrophen Faktors (CNTF)
Rückenmark Dissektion und Halten Medium
- L-15
- 10% fötalem Kälberserum
- 1% Pen-Strep
Inkubieren Eier bei 37-38 ° C. Sterilisieren Sezieren Werkzeuge und Sylgard Sezieren Gericht in 70% Ethanol. Dissecting Geschirr und Werkzeuge können auch UV sterilisiert Nacht.
1 ist. Bead Vorbereitung
- Legen Sie Perlen in einem Mikroröhrchen mit 1 ml steriler PBS, mischen, und warten Sie die Perlen auf den Boden des Röhrchens zu begleichen.
- Waschen Sie die Kugeln mehrmals durch das Entfernen der Überstand nach den Perlen niedergelassen haben und resuspendieren in PBS.
- Inkubieren Sie die Perlen in gereinigtes Protein (verdünnt in PBS) oder PBS allein (Control) für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Perlen in PBS und an einem 24-Well-Platte mit 1 ml PBS, bis in Kollagen platziert.
2. Statoacoustic Ganglion Dissektion
- Auf E4 entfernen der Embryo aus dem Ei und legen Sie sie in einer Schale mit Küken Ringer-Lösung zu embryonalen Membranen zu entfernen.
- Setzen Sie den Embryo in einem Sylgard © gesäumt Petrischale mit kaltem HBSS und die Position des Embryos auf die Seite mit dem otic Vesikel nach oben gefüllt. Pin des Embryos in die Schale mit Sezieren Pins.
- Mit zwei Sezieren Stifte, einen horizontalen Schnitt durch die Haut sofort ventral derKanal Beutel, ungefähr dort, wo es erfüllt die Ductus cochlearis. Machen Sie einen vertikalen Schnitt vorderen und hinteren der SAG. Verwenden einer Pinzette oder einem Seziertisch pin zu heben und entfernen Sie die Klappe der Haut durch die drei Schnitte begrenzt.
Hinweis: Die SAG ist in der anteroventral Rand des otocyst, etwa auf halbem Weg zwischen der dorsalen Tasche, die gut sichtbar mit Hellfeld Basis Beleuchtung und dem ventralen Ductus cochlearis, die ventromedial Projekte und wird von der Schlundbögen verdeckt. Der Ductus cochlearis verlängert so seine dorsoventrale Dimension wird schrittweise auf E4 Anstieg zwischen Hamburger-Hamilton Stufen 23-25 September.
- Ziehen Sie die otocyst nach dorsal um es aus der SAG zu trennen. Displace umgebende Gewebe der SAG mit Dissektion Pins und entfernen Sie vorsichtig die SAG aus dem Embryo mit Nr. 55 Pinzetten. Entfernen Sie große Stücke mesenchymale Gewebe und hervorstehende Nervenbündel aus der SAG.
- Mit einem breit-Mund-Pipettenspitze, übertragen Sie die Explantation einer24-Well-Platte mit 0,5 ml SAG Explantation halten Medium. Keep Explantate auf Eis oder bei Raumtemperatur für bis zu 4 Stunden.
3. Rückenmark Dissektion
- Entfernen Sie die E6 Embryo aus dem Ei und legen Sie sie in eine Schale mit Küken Ringerlösung. Entfernen Sie den Kopf und embryonalen Membranen.
- Setzen Sie den Körper in einer Sylgard © Sezieren Schüssel mit kaltem Rückenmark Dissektion Medium. Position und Pin des Embryos "ventral down" und caudal mit Blick auf den Experimentator. Legen Sie sezieren Stifte durch die einzelnen Gliedmaßen und durch das vordere Ende.
- Mit einer Pinzette und / oder sezieren Stifte, entfernen Sie vorsichtig Haut und Gewebe, bewegt sich in eine ventrale Richtung, bis der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks zu sehen ist.
- Cut der dorsalen Mittellinie des Rückenmarks mit einer Zerlegung pin, in einer posterior nach anterior Richtung, entlang der gesamten Länge des Rückenmarks. Dadurch entsteht ein "offenes Buch", wie die linke und rechte Seite des Rückenmarks zu trennen.
- Entfernen umliegenden Gewebes, seitlich, um das Rückenmark zu isolieren und setzen die Spinalganglien (DRG). Entfernen Sie die DRG und der Hirnhäute durch Reiben mit einem Sezieren Pin oder einer Pinzette zwischen dem Rückenmark und DRG.
- Entfernen Sie das Rückenmark aus dem Körper, indem Sie die Schwanzflosse am weitesten Ende des Rückenmarks mit einer Pinzette und anheben und vom Experimentator. Beseitigung der verbleibenden DRG und der Hirnhäute.
- Halten Sie das eine Ende des Rückenmark mit einer Pinzette (oder stecken Sie es in die Schale) und die Nutzung Vannas Schere entlang der ventralen Mittellinie geschnitten, um das Rückenmark zu halbieren.
- Halten Sie das eine Ende des Explantat mit einer Pinzette, um das Gewebe zu immobilisieren und benutzen Vannas Schere, kleine Explantate (100-500 um in der Länge) entlang der Länge des Gewebes geschnitten. Die Bodenplatte kann als ein klares Verdickung des Gewebes an einer Explantation Kante erkannt werden.
- Verwenden Sie einen Weithals-Pipettenspitze zu Explantate auf eine 24-Well-Platte übertragen mit 0,5 ml kalte Dissektion Medium. Keep Explantate auf Eis zu Gewebeviabilität, f zu erhaltenoder bis zu 4 Stunden.
4. Explantation Kultur mit gereinigten Proteinen zu Neuriten Reaktionstest
- Bereiten Sie eine 1,5 mg / ml Kollagen-Lösung in einem 15 ml konischen Rohr, auf Eis, nach den Anweisungen des Herstellers.
- Überprüfen Sie die Kollagen-Lösung hat einen pH-Wert von 7-7,4 mit pH-Indikatorpapier. Den pH-Wert durch Zugabe von NaOH in 1 ul.
- Transfer-Explantate auf eine 24-Well-Platte mit einem breiten Mund Pipettenspitze und saugen überschüssige Flüssigkeit. Mehrere Explantate können in einem gut kultiviert werden, sollte aber gelegt mindestens 500 pm voneinander entfernt sein von einander.
- 0,5 ml Kollagen, die gut mit dem Explantat. Position der Explantation an der unteren Oberfläche des Brunnens. Achten Sie darauf, jede Kultur völlig einstellen, bevor Sie mit dem nächsten gut, weil das Kollagen beginnt bei Raumtemperatur polymerisieren.
- Legen Sie die Kultur Platte auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 30-45 min, um das Kollagen zu polymerisieren. Wenn die Kollagen hat polymerisiertemrized es wird ein Gel ähnelt.
- 0,5 ml warmen Explantation Kulturmedium entweder mit gereinigten Proteinen (verdünnt in PBS) oder PBS (Control) ergänzt und bei 37 ° C, 5% CO 2. Auswirkungen auf Neuritenwachstum sichtbar sein soll von 24 Stunden.
HINWEIS: Wir haben das gleiche Protokoll zur Kultur SAG Explantate verwendet bis zu 42 Stunden.
5. Explantation Co-Kultur mit Protein-beschichteten Beads zu direktionale Neuritenwachstum Test
- Beginnen Sie mit Explantation Kultur Schritte 4,1-4,4.
- Mit einer Pipette, Transfer 1-5 Kügelchen aus PBS, die gut mit den Kollagen-Lösung und Explantation.
- Verwenden einer Pinzette, um Perlen 50-500 um vom Rand der Explantation Position.
- Legen Sie die Platte auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 30-45 min, um das Kollagen zu polymerisieren. Die Gewebe-oder Wulst kann sich verschoben, wie das Kollagen polymerisiert. Überprüfen Sie die Kulturen und neu positionieren das Gewebe und Perlen in den ersten 5 min.
- Add 0,5 ml SAG Medien in jede Vertiefung und inkubieren für 24 Stunden.
6. Visualisierung von Neuriten durch Immunhistochemie
- Spülen Kulturen in PBS und fixieren Sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 4% Paraformaldehyd in PBS.
- Lassen Sie die Gele aus den Wänden der Vertiefungen durch Tracing um den Rand der Gele mit den abgerundeten Ende einer Teflon-micro Spachtel. Führen Sie die immunostain mit den Gelen in die Vertiefungen geben. Spülen Sie mehrmals in PBS.
- Inkubieren in 0,5 ml Blocking-Lösung (10% Kälberserum, 0,1% Triton X-100, 0,1% Natriumazid in PBS) über Nacht bei 4 ° C.
- Inkubieren in 0,5 ml primären Antikörper (Anti-β-Tubulin-Antikörper 1:500 verdünnt in Blockierungslösung) über Nacht bei 4 ° C.
- Spülen Sie mehrmals in PBS. Inkubieren in 0,5 ml sekundären Antikörper (Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG 2b Antikörper verdünnt 1:500) über Nacht bei 4 ° C. Von diesem Schritt nach vorn, halten Platten in dunklen oder wickeln Sie sie in Folie, durch die Empfindlichkeit des LichtsSekundärantikörper.
- Spülen Sie mehrmals in PBS und lagern bei 4 ° C in PBS bis zu einer Woche.
7. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse des Neuriten-fördernde Wirkung von gereinigtem NT-3 und NT-3-beschichteten Kügelchen auf E4 chick SAG Explantate. SAG Neuron Zellkörper und Neuriten wurden mit β-Tubulin immungefärbt und bebildert mit einem 10-fach Objektiv auf einem konfokalen Mikroskop. Nach 24 Stunden in vitro, angezeigt SAG Explantate größere Neuritenwachstum in Gegenwart von 100 ng / ml gereinigtes humanes NT-3 auf dem Zellkulturmedium (1B) aufgenommen, im Vergleich zur Kontrollgruppe (1A). SAG Neuronen wurden mit Perlen eingeweicht in 100 ng / ml NT-3 zu zeigen, dass eine Punktquelle von NT-3 kann vor Ort zu fördern Neuritenwachstum co-kultiviert. Explantate angezeigt länger und dichter Neuritenwachstum auf der Seite desExplantation mit Blick auf den Wulst auf der gegenüberliegenden Seite (1D) im Vergleich und im Vergleich zu Kulturen mit Perlen in PBS (1C) getränkt Kontrolle. Maßstab = 200 um.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse des Neuriten-fördernde Wirkung von gereinigtem Wnt5a und Wnt5a-beschichteten Kügelchen auf E6 chick Rückenmark. Rückenmark Explantate wurden mit β-Tubulin immungefärbt und bebildert mit einem konfokalen Mikroskop. Nach 24 Stunden Wachstum in Gegenwart von gereinigtem Maus Wnt5a (400ng/ml), Neuritenwachstum von chick Rückenmark Explantate wurde erhöht (2B), die Kontrollen ohne Wnt5a (2A) kultiviert verglichen. Beads in 500 ng / ml Wnt5a eingeweicht, platziert 300-500 um von der Kante des Rückenmarks Explantate, ebenfalls gefördert Neuritenwachstum (2D) im Vergleich zu Kulturen (2C) zu steuern. Ähnliche Co-Kultur-Ergebnisse waren zuvor mit Wnt5a-exprimierenden Zellen 8 veröffentlicht. Maßstabsbalken = 200um.
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Diskussion
Wir stellen eine Methode zu sezieren und Kultur E4 und E6 SAG Rückenmark Explantate von chick, unter serumfreien Bedingungen. Dieses Verfahren wird derzeit in unserem Labor verwendet werden, um die Auswirkungen von verschiedenen sezernierten Liganden auf SAG Neuron Überleben und Neuritenwachstum zu studieren. Neue Aspekte dieses Protokolls sind die Verwendung eines serumfreien System zur Kultivierung von Explantaten und die Verwendung von Perlen in Wachstumsfaktoren getränkt, um Auswirkungen auf die SAG Neuritenwachstum...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants RO1DC002756 und der Purdue Research Foundation finanziert. Wir bedanken uns bei Doris Wu und Chang Wiese für Beratung mit Experimenten und Rodney McPhail für die Hilfe bei Zahlen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagens | Firma | Katalog-Nummer | Kommentar |
| Ausrüstung | |||
| Dissektionsmikroskop | Wir verwenden ein Stereomikroskop Leica M80 mit Hellfeld Basis Beleuchtung | ||
| Slide wärmer | CS & E. | Collagen Polymerisation | |
| Hühnerei-Inkubator | |||
| 37 ° C / 5% CO 2 befeuchtet Zellkulturbrutschrank | |||
| Dissection Materials | |||
| Sylgard © beschichtete Petrischale | |||
| 24-Well-Zellkulturplatte | Corning | 3526 | |
| # 5 Dumont Pinzetten | Feine Science Tools | 11252-30 | |
| # 55 Dumont Pinzetten | Feine Science Tools | 11295-51 | |
| Edelstahl Sezieren Pins | Feine Science Tools | 26002-10 | Embryo Pinning, feinen Sezierung |
| Moria Schaumlöffel | Feine Science Tools | 10370-17 | Embryo Ernte / Transfer |
| 200 ul breiten Mund Pipettenspitzen | Dot Scientific Inc | 118-96R | Explantation Transfer |
| E4 und E6 Hühnereiern | & Nbsp; | ||
| Küken Ringer-Lösung | Embryo Ernte | ||
| HBSS | Sigma | H8264 | SAG Dissektion |
| L15 Medium | Sigma | L5520 | Rückenmark Dissektion Medium |
| Fötalem Kälberserum | Atlanta Biologicals | S11150 | Rückenmark Dissektion Medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501778 | Rückenmark Dissektion |
| Collagen Vorbereitung | |||
| Rat-tail Kollagen Typ I | BD Biosciences | 354249 | Explantation Kultur |
| 10X PBS (steril) | Um neutralize Kollagen | ||
| 1N NaOH (steril) | Zur Neutralisierung Kollagen | ||
| Destilliertes Wasser (steril) | Zur Neutralisierung Kollagen | ||
| pH-Indikator Papiere (6,0-8,1) | Whatman | 2629-990 | Um zu überprüfen, Kollagen pH |
| 15 ml konischen Röhrchen | Dot Scientific Inc | 818-PG | |
| 500 ul breiten Mund Pipettenspitzen | Dot Scientific Inc | 119-R100 | Um pipet Kollagen |
| Explantation Kultur | |||
| DMEM/F12-Medium | Sigma | D8437 | Explantation Kulturmedium |
| Ihre +1 | Sigma | I2521 | Medium ergänzen |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Medium ergänzen |
| CNTF (Ratte) | Sigma | C3835 | Medium ergänzen |
| NT-3 (human) | Sigma | N1905 | Medium ergänzen |
| Gereinigtes Maus Wnt5a | R & D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-Gel Blue Gelperlen | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Immunhistochemie | |||
| Paraformaldehyd | Sigma | P6148 | Fixierung |
| PBS | Spülungen | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Blocking-Lösung |
| NatriumAzid | Sigma | S8032 | Blocking-Lösung |
| Kälberserum | Invitrogen | 16170-078 | Blocking-Lösung |
| Monoklonalen Maus-IgG2b anti-β Tubulin 1 + II Antikörper | Sigma | T8535 | Labels Zellkörper und Neuriten |
| Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG2 b-Antikörper | Invitrogen | A21141 | Erkennt β Tubulin Antikörper |
| Teflon Mikrospatel | VWR | 57949-033 | Veröffentlichung Kollagengelen von gut |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
