Summary
We hebben geoptimaliseerd een micro-inkapseling techniek als een effectief 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van embryonale stamcellen endoderm en dopaminerge (DA) neuronen. Het biedt ook een kans voor immuun-isolatie van cellen van de gastheer tijdens de transplantatie. Dit platform kan worden aangepast voor andere celtypen.
Abstract
Menselijke embryonale stamcellen (hESC) zijn in opkomst als een aantrekkelijk alternatief voor cel-therapie omdat ze kunnen worden uitgebreid in cultuur voor onbepaalde tijd en gedifferentieerd om alle soorten cellen in het lichaam. Verschillende soorten van biomaterialen zijn ook gebruikt stamcellen culturen een micro nabootsen van de stamcel nis 1-3 geven. Dit laatste is belangrijk voor het bevorderen van cel-cel interacties, cel proliferatie en differentiatie in specifieke afstammingslijnen als weefsel organisatie door een driedimensionale (3D) omgeving 4 zoals inkapseling. Het principe van de cel inkapseling omvat beknelling van levende cellen binnen de grenzen van semi-permeabele membranen in 3D culturen 2. Deze membranen voor de uitwisseling van voedingsstoffen en zuurstof stimuli over de membranen, terwijl antilichamen en immuuncellen van de gastheer die groter zijn dan de capsule poriegrootte uitgesloten 5. Hier wordt voorafstuurde een benadering van cultuur en te differentiëren hESC DA neuronen in een 3D micro-omgeving met behulp van alginaat microcapsules. We hebben gewijzigd de kweekomstandigheden 2 tot en met de levensvatbaarheid van ingekapselde hESC te verbeteren. We hebben eerder aangetoond dat de toevoeging van p160-Rho-geassocieerde coiled-coil kinase (ROCK) remmer, Y-27632 en menselijke foetale fibroblast-geconditioneerd serum vervanging medium (HFF-CM) om het 3D-platform aanzienlijk verbeterd de leefbaarheid van ingekapselde hESC waarbij de cellen uitgedrukt definitieve endoderm merkergenen 1. We hebben nu gebruik gemaakt van deze 3D-platform voor de verspreiding van hESC en efficiënte differentiatie naar DA neuronen. Eiwit en genexpressie analyses na de laatste fase van de DA neuronale differentiatie toonde een verhoogde expressie van tyrosine hydroxylase (TH), een marker voor DA neuronen,> 100 plooien na 2 weken. Onze hypothese was dat onze 3D-platform met behulp van alginaat microcapsules kan nuttig zijn om de proliferatie te bestuderen en gericht differentiatievan hESC naar verschillende geslachten. Deze 3D Tegelijkertijd kan de scheiding van feeder cellen hESC tijdens het proces van differentiatie en ook mogelijke immuun-isolatie tijdens transplantatie in de toekomst.
Protocol
Alle van de onderstaande procedures worden uitgevoerd met behulp van aseptische technieken in een klasse II bioveiligheid kabinet. Reagentia en apparatuur zijn vermeld in de onderstaande tabellen.
1. Bereiding van 1,1% alginaat (w / v)
- Voeg 0,275 g gezuiverd natriumalginaat (hoog gehalte glucuronzuur ≥ 60%, viscositeit> 200 mPa s, en endotoxine ≤ 100 EU / g) in een steriele 50 ml buis en voeg 25 ml steriele 0,1% gelatine oplossing eerder bereid (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H 2 O en opgelost door autoclaveren).
- Vortex de buis gedurende ongeveer 30 seconden om gedeeltelijke ontbinding van de alginaat poeder en plaats de buis op een orbitale mixer bij 10 xg voor overnachting (kamertemperatuur).
- Voeg 2,778 ml van 9% steriele NaCl (4,5 g NaCl/50 ml milli-Q H 2 O) 25 ml alginaat oplossing. Vortex de buis gedurende ongeveer 30 seconden, gevolgd door centrifugatie bij 95 x g gedurende 5 minuten.
- Bewaar de alginaat oplossing bij 4 °; C voor korte-termijn opslag (1-2 maanden) of bij -20 ° C voor opslag op lange termijn (ongeveer een jaar).
2. Voorbereiding van CaCl 2 Neerslag Bad
- Los 14,7 g CaCl2. 2H 2 O en 2,38 g HEPES in 1 liter milli-Q H 2 O
- Stel de pH-waarde tot 7,4.
- Steriliseren de oplossing met een 0,22 pm filter.
- Neerslag bad kan worden bewaard bij kamertemperatuur (6-12 maanden).
3. Voorbereiding van ontkapselen Solution
- In 500 ml fosfaat Dulbecco's gebufferde fysiologische zoutoplossing (D-PBS), voeg 50 ml van 0,5 M EDTA en 5 ml 1M HEPES.
- Steriliseren met een 0,22 pm filter of autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
- Bewaar de ontkapselen oplossing bij kamertemperatuur (6-12 maanden).
4. Voorbereiding van Serum Vervanging (SR) Medium
- Voorafgaand aan de inkapseling, voor te bereiden SR medium van te voren als debeschreven in Tabel specifieke reagentia en materialen.
5. Voorbereiding van ROCK Inhibitor (Y-27632)
- Verdun Y-27632 poeder in 0,1% humaan serumalbumine (HSA) in PBS-D een 5 mM oplossing.
6. Voorbereiding van hESC voor inkapseling
- Behandel de cellen gekweekt medium aangevuld met 10 pM ROCK inhibitor (RI) gedurende twee uur bij 37 ° C (bescherming tegen licht).
- Na de RI behandeling cellen tweemaal wassen met PBS-D en los van de cellen van kweekplaten enzymatisch met Accutase gedurende 10 min bij 37 ° C.
- Voorzichtig schrapen de cellen met de pipet of celschraper en verzamel in een 15 ml buis. Neutraliseer het Accutase met SR medium in 1:1 verhouding.
- Een enkele celsuspensie bereiden filteren geneutraliseerd cellen met een 40 pm filter en op in een verse 50 ml centrifugebuis.
- Bereken de totale aantal cellen in de oplossing met een hemacytometer. Centrifugeer de celsuspensie 95 xg gedurende 5 min en zorgvuldig daarna Verwijder de bovenstaande vloeistof. Was de cellen met voorverwarmde 0,9% NaCl. Centrifugeer 95 xg gedurende 5 minuten en gooi het supernatant.
7. Inkapseling van cellen
- Bereid een 1 ml spuit aan een zachte kunststof slang van 14G x 2 "IV katheter. Deze wordt gebruikt om de celsuspensie wordt geladen op het spuitpomp zoals getoond in figuur 1 te zuigen.
- De cellen resuspenderen met voorverwarmd alginaatoplossing bij een dichtheid van 1,25 miljoen cellen / ml alginaat. Meng voorzichtig met de spuit en voorkomen dat er bubbels.
- Stel de kraal generator, spuitpomp de luchtstromingsmeter zoals weergegeven in figuur 1. Meer details van deze apparaten in tabel specifieke reagentia en materialen.
- Met de cellen opgezogen in de spuit, verwijder de plastic buis van IV katheter en bevestig de spuit aan de inkapseling machine. Zorg ervoor dat er een 10 cm te zijn gat tween het einde van de inkapseling machine en de verzamelplaats zoals weergegeven in figuur 1.
- Kapselen de cellen door de spuitpomp bij 20 ml / uur luchtstroom 8 L / min en een druk van 100 kPa (de grootte van capsules kan worden gewijzigd door de luchtstroom).
- Verzamelen van de ingekapselde cellen in een petrischaal (100 x 15 mm) gevuld met 20 ml voorverwarmde precipitatie bad 7 min de capsules stabiliseren.
- Breng de ingekapselde cellen door voorzichtig inademing in 50 ml centrifugebuizen gevuld met 20 ml 0,9% NaCl.
- Laat de capsules om zich te vestigen in de bodem van de buis dan voorzichtig Verwijder de bovenstaande vloeistof. Herhaal het wasproces met 0,9% NaCl.
- Resuspenderen de ingekapselde cellen in voorverwarmde kweekmedium aangevuld met RI (10 uM), te brengen in een cultuur kolf en geïncubeerd bij 37 ° C / 5% CO2.
8. Differentiatie van Encapsulated hESC naar DA neuronen
ve_content "> De ingekapselde hESC worden behandeld met RI gedurende 3 dagen voorafgaand aan differentiatie.- Zaad de muis stromale cellijn PA6 cellen een dichtheid van 1,0 x 10 4 per cm2 0,1% gelatine beklede T75 kolf en de toestand van de PA6 cellen DA neurale differentiatie medium (Tabel Materials) 24 uur voor de differentiatie.
- Breng de capsules in een 50 ml centrifugebuis en laten bezinken tot de bodem van de buis.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de capsules in PA6 cel met airconditioning DA neurale differentiatie medium.
- Cultuur de ingekapselde hESC met de PA6 celmonolaag (9 x 10 6 hESC 's per 7,5 x 10 5 PA6 cellen) gedurende 28 dagen met een media-verandering op dag 4 en om de dag daarna (veranderen slechts de helft van het medium per keer).
- Na 3 weken in cultuur PA6 cellen aanvullen DA neurale differentiatie medium met 100 ng / ml SHH en 100 ng / ml FGF8a de resterende week.
9. Decapsulation van ingekapselde hESC
- Zuig de capsules in een 15 ml centrifugebuis zodat ze op de bodem van de buis. Vervolgens voorzichtig Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Was de capsules met D-PBS twee keer. Laat de capsules op de bodem van de buis vervolgens de supernatant.
- Voeg 5 ml ontkapselen oplossing voor de capsules. Meng de suspensie via streven voor incubatie bij kamertemperatuur gedurende 4-5 minuten.
- Centrifugeer het decapsulated cellen bij 95 xg gedurende 3 minuten en gooi het supernatant.
- Was de celpellet D-PBS gevolgd door centrifugatie bij 95 xg gedurende 3 minuten. Herhaal.
- De decapsulated cellen verder gekweekt als een monolaag of voor downstream analyse.
10. Representatieve resultaten
De diameter van alginaat microcapsules is 400-500 pm. Het aantal cellen in de capsule was estimated door berekening van het aantal cellen gedeeld door het totale aantal capsules per run. Daarom werd ongeveer 5,0 x 10 4 cellen per capsule geschat. Hieruit Wij veronderstellen dat het maximum aantal cellen van de capsule kan bevatten ongeveer 1,0 x 10 5. De levensvatbaarheid van ingekapselde hESC> 80% (figuur 2) zoals bepaald met behulp carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidly ester (CFDA) / propidium jodide (PI) assay. We hebben optimale voorwaarden van hESC inkapseling door de geringere alginaat concentratie van 2,2% tot 1,1% en het veranderen van de precipitatiebad van bariumchloride om calciumchloride. Van deze voorwaarden, hebben we laten zien dat alleen de cellen die werden ingekapseld met 1,1% calcium alginaat kunnen overleven, groeien en vormen EBS in vitro 1. Verder optimaliseren van de aandoening, de gevolgen van kweekmedia en RI, werden Y-27632 onderzocht. De gegevens weergegeven in figuur 2 en 3 tonen aan dat RI prevented dissociatie-geïnduceerde apoptose en onderhouden levensvatbaarheid van de cellen en bevorderd clustervorming 1,6. Bovendien is de levensvatbaarheid van ingekapselde hESC gekweekt in HFF-CM + RI was significant hoger dan bij andere groepen zonder RI suppletie, maar dit was niet significant verschillend van ingekapselde hESC gekweekt in SR + RI. Ook celproliferatie met BrdU test gestegen van 25% tot 75% als enkele cellen zich ontwikkeld tot clusters (figuur 3). Apoptosis assay van TUNEL gebleken dat de afzonderlijke cellen in microcapsules gekweekt in medium SR apoptotische waren (gegevens niet getoond) dat de clusters opgehaald uit het HFF-CM waren meestal negatief TUNEL. Tot op zekere hoogte, HFF-CM aangevuld met bFGF ook bevorderd de overleving en groei van ingekapselde hESC 'in de afwezigheid van Y-27632. Echter, de behandeling met Y-27632 voor (2 uur) en na inkapseling (tegen 4 dagen) aanzienlijk verbeterde levensvatbaarheid, proliferatie en clustervorming van de ingekapselde hESCbij 1,1% calciumalginaat microcapsules.
Eerder toonden we aan dat ingekapselde hESC met succes kan worden gedifferentieerd om definitieve endoderm 1. Hier hebben we gekeken naar de toepassing van de cel inkapseling als een 3D-platform om ingekapselde hESC differentiëren in DA neuronen. hESC, dat embryoid instanties (EB) gevormd in capsules waren direct gedifferentieerde en op decapsulation onder de beschreven omstandigheden toonde een progressieve neuronale morfologie (figuur 4) na 2-3 dagen van cultuur met meer dan 90% levensvatbaarheid. Genexpressie analyse toonde een down-regulatie van pluripotente marker, OCT4 terwijl neuroprogenitor marker, PAX6 en DA neuronale marker, TH waren up-gereguleerd na 7 dagen van differentiatie (figuur 5A). Immunofluorescentie kleuring bleek dat gedifferentieerde hESC waren PAX6-positief (> 80%), maar OCT4-negatief op dag 7. Verder gedifferentieerde hESC heeft TH-positieve (> 90%) neuronen na 21 dagen (figuur 5B). Western blot analyse toondeeen up-regulatie van TH expressie van dag 14 (figuur 5C), terwijl PAX6 uitdrukking was down-gereguleerd na dag 21. In vergelijking de cellen gekweekt onder tweedimensionale (2D) milieu onder dezelfde omstandigheden (bijvoorbeeld RI voorbehandeling 2 uur RI nabehandeling gedurende 3 dagen voor differentiatie) gehandhaafd een hoog percentage PAX6-positieve cellen (> 80 %) gedurende de differentiatie en werden minder efficiënt in onderscheiden TH-positieve cellen (<60%) als in 3D milieu door inkapseling (Figuur 5A en C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende studies met behulp van muis embryonale stamcellen en hESC hebben aangetoond dat de voordelen van 3D-cultuur systeem in biomaterialen en tissue engineering 2,3. We calciumalginaat microcapsules gebruikt als geschikt 3D platform hESC vermeerdering en differentiatie te bestuderen in vergelijking met barium alginaat omdat hESC lieten een significant verhoogde levensvatbaarheid als ingekapseld in calciumalginaat dan barium alginaat. Deze cultuur-systeem maakt het ook mogelijk een high-density celkweek en de uitwisseling van voedingsstoffen en zuurstof over het membraan 7. Spontane differentiatie in de capsules eerder waargenomen en wordt verondersteld dat, ongedifferentieerde hESC blijven vermenigvuldigen binnen de capsules de cellen zou uiteindelijk uitbreken van de capsules en vorm teratoma 1. Een andere klinische toepassing van inkapseling is om immuun bescherming van de getransplanteerde cellen van de gastheer ontvanger. Verwacht wordt dat transplantatie van hESC en ThMER-derivaten kan leiden tot de immunologische afstoting, omdat het lage niveau van expressie van MHC klasse I-antigenen van ongedifferentieerde hESC verhoogd is na differentiatie 8. Ook is aangetoond dat transplantatie meestal hogere concentraties alginaat gebruikt om de afstoting te omzeilen 2,9. De studie wordt een lagere concentratie van alginaat (1,1%) die meer geschikt is voor de in vitro differentiatie van hESC. Het is nog te worden vastgesteld of de lagere concentratie van alginaat wij hebben gebruikt zouden illegale een vergelijkbare immuunrespons, zoals eerder rapporten alsmede het onderhouden van levensvatbaarheid van de cellen moeten deze ingekapselde hESC worden getransplanteerd in een immunocompetente gastheer.
De optimale inkapseling protocol voor het inkapselen hESC produceert capsules grootte van 400-500 pm diameter. Capsules die kleiner dan 400 pm hebben minder cellen terwijl grotere capsules (> 500 pm) result in overbevolkt cellen. hESC inkapseling is een enkele cel formatie, die ook cellen bevordert apoptose 6. We hebben hier aangetoond dat ingekapselde hESC kan blijven om te overleven, groeien en vormen EB. Dit wordt versterkt door voorbehandeling van de hESC met RI voor inkapseling, waardoor> 80% hESC levensvatbaar. Zo hebben we een model van cultuur hESC in 3D kweekomstandigheden en hebben uitgebreid deze onderzoeken voor gerichte differentiatie in DA neuronen. Hoewel de cel inkapseling techniek is op grote schaal bekend om celcultuur en endodermale differentiatie, neurale differentiatie onder deze omstandigheden is niet grondig 10,11 bestudeerd. We hebben hier aangetoond dat er een verhoogde expressie van PAX6 en TH met behulp van gen-en eiwitexpressie analyses na 7 dagen in vergelijking met de 2D-differentiatie systeem, wat suggereert dat de 3D-omgeving beter DA neuronale lijn bevordert van pluripotente staat. Echter, verdere analyses succesh als dopamine secretie test-en transplantatie-test nodig zijn om het volledig karakteriseren van de gedifferentieerde cellen. Het genereren van robuuste functionele DA neuronen efficiënt is een essentiële voorwaarde als celtherapie voor de ziekte van Parkinson is om een werkelijkheid. Onze 3D-platform, zoals voorgesteld over co-kweken met DA neurale cellen induceert, PA6 cellen en high-density celkweek systeem van DA neuronale gedifferentieerde hESC via inkapseling is een streven naar die richting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door NHMRC Program Grant # 568969 (PSS) en de Faculteit der Geneeskunde van de Universiteit van New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. Orive, G. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
