Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets

Summary

Die CLEM Technik angepasst worden, um ultrastrukturelle Morphologie der Membranen, Organellen und subzelluläre Strukturen mikroinjizierten Moleküle beeinflusst analysieren. Diese Methode kombiniert die leistungsstarke Techniken der Mikromanipulation / Mikroinjektion, konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu ermöglichen Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Diese Technik ist zugänglich für eine breite Vielzahl von Anwendungen.

Abstract

Die eukaryotische Zelle beruht auf komplexen, stark regulierten und funktionell unterschiedlichen membrangebundene Kompartimente eine biochemische Polarität notwendig für korrekte zelluläre Funktion zu bewahren. Verstehen, wie die Enzyme, Proteine ​​und Zytoskelett-Komponenten und regeln pflegen diese biochemischen Segregation ist daher von größter Bedeutung. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Moleküle und / oder stören subzellulären Kompartimenten hat eine Fülle von Wissen nachgegeben und zu unserem Verständnis der zellulären Regulation lokalisieren. Bildgebende Verfahren wie fluoreszierende und konfokale Mikroskopie machen Ermittlung der Position eines fluoreszierend markierten Kleinmolekül relativ einfach, jedoch wird die Auflösung des sehr kleinen Strukturen ¹ begrenzt.

Auf der anderen Seite hat Elektronenmikroskopie Einzelheiten subzellulären Morphologie bei sehr hoher Auflösung offenbart, sondern seine statische Natur erschwert hochdynamischen Pro messenProzesse mit Präzision ^2,3. So ergibt die Kombination von Lichtmikroskopie mit Elektronenmikroskopie der gleichen Probe, genannt Korrelative Light and Electron Microscopy (CLEM) ^4,5, die zwei Vorteile ultraschnellen Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher Auflösung der Elektronenmikroskopie ^6. Diese leistungsstarke Technik wurde eingeführt, um viele Aspekte der Zellbiologie ^5,7 studieren. Seit seiner Gründung hat sich dieses Verfahren unsere Fähigkeit zur subzellulären Architekturen und Morphologien in hoher Auflösung zu unterscheiden erhöht.

Hier präsentieren wir eine optimierte Methode zur raschen Durchführung Mikroinjektion von CLEM (Abb. 1) gefolgt. Die Mikroinjektion CLEM Verfahren kann verwendet werden, um bestimmte Mengen von kleinen Molekülen und / oder Proteine ​​direkt in der eukaryotischen Zelle Zytoplasma einzuführen und die Wirkungen von Millimeter zu Multi-Nanometer-Auflösung (Abb. 2). Die Technik basiert auf der Grundlage MikroinjizierenZellen auf Laser Ätzglas gerasterten Deckgläser befestigt an der Unterseite der Lebendzelldichte Geschirr und Bildgebung sowohl konfokale Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie gewachsen. Lokalisierung der Zelle (n) von Interesse vom Gittermuster, die leicht übertragen wird, zusammen mit den Zellen von Interesse zur Epon Harz zur Immobilisierung von Proben verwendet und Schaltstellen vor elektronenmikroskopische Analyse (Abb. 3) erleichtert. Überlagerung von Fluoreszenz-und EM-Bilder ermöglicht dem Benutzer, die subzelluläre Lokalisation sowie jegliche morphologischen und / oder ultrastrukturelle Veränderungen durch die mikroinjizierten Molekül von Interesse (Abb. 4) induziert wird. Diese Technik ist zugänglich Zeitpunkten von ≤ 5 s bis zu einigen Stunden, abhängig von der Natur des mikroinjizierten Probe.

Protocol

Ein. Mammalian Cell Culture

1. Normale Rattenniere (NRK), immortalisierten Gebärmutterhalskrebs (HeLa) oder andere geeignete Säugerzelllinien werden bei 37 ° C, 5% CO _2, unter photogeätzten Glas gerasterten Deckgläser befestigten Geschirr Zelle lebt (siehe Tabelle 1 für jede Reagenz oder Vorrichtung in diesem Protokoll verwendet) in DMEM + 10% FBS und 1% Pen / Strep. Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um eine sterile Umgebung beizubehalten, wenn die Arbeit mit kultivierten Säugetierzellen werden.
2. Je nach Ihrer Versuchszeit-line (0-5 Stunden vs 1-2 Tage nach der Injektion) die Konfluenz der Zellen sollte ~ 50% eingestellt werden oder ~ 25% betragen.

2. Mikroinjektion

1. Planen gewünschte Protein, DNA, oder kleinen Molekülen in der Wahl der Puffer in Abhängigkeit von ihrer Zugänglichkeit für Zellkultur, zu einem Endvolumen von ~ 50 pl. Inerten fluoreszierenden Farbstoffen wie Texas Red oder Cascade Blueenthalten sind, um die mikroinjizierten Zellen kennzeichnen; Wahl der Injektion Farbstoff und fluoreszierende Sonde sollte nicht überlappenden Anregungs-und Emissionswellenlängen haben. Die Konzentration des Moleküls von Interesse für die Mikroinjektion benötigt sollte empirisch bestimmt werden, und die fluoreszierenden Farbstoffe werden üblicherweise Tracking bei 0,5-1,0 mg / ml verwendet. Typischerweise wird Rhodamin oder ein anderer Fluorophor kovalent an dein Molekül von Interesse unter Verwendung eines kommerziellen Kits befestigt jedoch andere Verfahren zur Detektion verwendet werden, können je nach Empfindlichkeit werden. Für weitere Informationen, siehe Kritische Überlegungen unten.
2. Filtern Sie die Injektionsmittel (~ 50 ul) durch einen 0,22 um Zentrifugalfilter. Centrifugal Filter werden über Vakuum und / oder Spritze Filtration, die Totvolumina zugeordnet haben bevorzugt.
3. Um die Mikroinjektionsnadel erzeugen, werden Borosilikatglas Pipetten zog mit einem flammenden-Brown Feinpipettenziehvorrichtung folgenden Herstellern Richtlinien. Alternativ MikroinjektionNadeln können von Anbietern wie Eppendorf, die Femtotip Mikroinjektion Nadeln macht erworben werden.
4. Sorgfältig pipettieren 4 ul Injektionsmittelkammer in die unbehelligt Ende des Mikroinjektionsnadel mit Eppendorf 20 Femtotips. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen innerhalb des herausgezogen Mikroinjektionsnadel sind. Legen Mikroinjektionsnadel in den Mikromanipulator Arm des Eppendorf FemptoJet InjectMan an einem inversen Mikroskop. Für einen guten Überblick über die Mikroinjektion Verfahren wird der Leser auf einen früheren Journal of Visualized Experiments Artikel ⁸ gerichtet.
5. Zeigen live cell Teller mit Gitternetz Deckglas und kultivierten Zellen in der Schale Inhaber des invertierten Zeiss-Mikroskop. Finden wachsenden Zellen innerhalb eines fotogeätzten Netz und beachten Sie den Gittern alphanumerische Kennung, wird diese in allen nachfolgenden Schritten verwendet werden. Idealerweise lokalisieren Zellen in der Mitte des Deckplättchens als nachfolgende Schritte werden Probentransfer an den Kanten des Deckglases begrenzt.
6. Manuell unteren Injektionsarm einrastet über dem Deckglas und Verwenden des Mikromanipulators Joystick und Steuerelemente, niederes Injektionsnadel nach unten, bis die Spitze sanft berührt die Oberfläche der kultivierten Zellen und drücken 'Limit, um eine Bewegung der Nadel über diesen Punkt hinaus zu verhindern und so brechen die zerbrechliche gezogen Borosilikatglas. Alle anderen Aspekte der Zell-Mikroinjektion werden nach Eppendorf FemtoJet InjectMan Bedienungsanleitung durchgeführt. Die Mikroinjektionstechnik wurde kürzlich verwendet, um einzelne abgesondert Virulenzproteine ​​von Bakterien ⁹ verstehen.
7. Microinject jeder anderen Zelle innerhalb des gewählten Gitters. Mit Zellen bei ~ 50% Konfluenz gezüchtet, kann man erwarten ~ 80 Zellen pro 600 um ² Rasters (Beispiel in gezeigt. 3A). Daher wird bei Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie Inspektion, wird es eine n von ~ 30-40 Versuchs-und Kontrollgruppen Zellen sein.
8. Zeigen live-cell Teller zurück in Säugetier-Zellkultur-Inkubator für die gewünschteZeit diktiert durch die Versuchsanordnung. Alternativ kann man unmittelbar aus Mikroinjektion Zeitraffer-Mikroskopie-Analyse, um das Aussehen von besonderer subzellulären Strukturen von Interesse vor der Fixierung zu erwarten.

3. Fluorescent Microscopy

1. Falls gewünscht, durchzuführen lebenden Zellen Zeitraffer Fluoreszenzmessungen von mikroinjizierten Zellen, wonach die Stelle der Medien mit 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylat-Puffer (pH 7,4) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Wenn jedoch Messungen lebenden Zellen nicht erforderlich sind, zu verwerfen Zellwachstumsmedium und fixieren die Zellen mit 5 ml 3,7% Formaldehyd in 1xPBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entsorgen Fixiermittel und ersetzen mit 5 ml 1xPBS, fahren 3,2 fort. Hinweis: Es ist wichtig, nicht zu Glutaraldehyd erst nach Fluoreszenzmikroskopie ist komplett hinzuzufügen.
2. Legen Sie die Live-Cell-Teller mit fotogeätzten gridded Deckglas in einem Fluoreszenzmikroskop (konfokale ist nicht für thi erforderlichs Schritt) und sammeln 5-10 Hellfeld und fluoreszierenden Bildern des entsprechenden Gitters, um die Anordnung der Zellen (Abb. 4A) dokumentieren. Identifizieren derjenigen Zellen mikroinjiziert worden sind mit den Anregungs-und Emissionswellenlängen des inerten Farbstoffs Injektion (4B). Es ist wichtig, um Bilder in verschiedenen Vergrößerungen (zB 10x und 65x) zu erhalten, um die Identifikation von mikroinjizierten Zellen in nachfolgenden Schritten mit Elektronenmikroskopie erleichtern.
3. Mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop, sammeln ein Z-Stapel mikroinjizierten Zellen innerhalb des Gitters in Schritt 2.5 oben identifiziert. Hoher Vergrößerung (100x) wird benötigt, um Fluoreszenzbilder mit subzellulären Strukturen, die in der Elektronenmikroskopie ermittelt werden korrelieren.
4. Die Deckgläser werden vom Boden der Lebendzelldichte Gerichte mit handelsüblichen Entschichtungsflüssigkeit Deckglas entfernt und Zell-Seite nach oben in einem unberührten Zellkulturschale enthaltend 5 ml1xPBS. Das Deckglas wird dann für die Elektronenmikroskopie verarbeitet wie unten.

4. Transmission Electron Microscopy

1. Ersetzen 1xPBS Puffer mit 2 ml 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylat-Puffer (pH 7,4) und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Längere Inkubationszeit, die zwar nicht notwendig, wird in der Instandhaltung von subzellulären Strukturen zu unterstützen. Hinweis: Formaldehyd allein ist keine ausreichende Fixativ für EM-Analyse.
2. Entfernen Fixiermittel und Beize Zellen mit der Zugabe von 2 ml 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Cacodylat-Puffer für 30 min mit drei Waschungen mit Cacodylatpuffer und schließlich gefolgt ersetzen aller Puffer mit ddH ₂ O.
3. Nach Standard-EM-Protokolle, dehydrieren die Probe in einer abgestuften (70% bis 100%) Reihe von Ethanol. Bereiten Epon Harz und Deckglas Zell-Seite nach unten auf die Oberseite eines Epon Harz gefüllten Röhre. Erlauben Polymerisation für 24 Stunden bei 60 ° C. Indem Sie die fotogeätzten gridded Deckglas Zell-Seite zu tunwn auf die Epon Harz, wird sowohl die Zellen von Interesse als auch die Gittermuster der Epon Harzes während der Polymerisation überführt (Beispiel in gezeigt. 3B).
4. Entfernen von Deckgläsern Epon Harz durch schnell Eintauchen in flüssigen Stickstoff und / oder kochendem Wasser. Überprüfen Sie die Oberfläche des Harzes unter einem Binokular Dissektion Rahmen, um das Raster von Interesse (Hinweis: Das Gitter patter wird als Spiegelbild zu übertragen) zu lokalisieren. Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge oder Skalpell, trim die Epon Block unten, so daß nur das Raster des Interesses an der Spitze der Epon Harzblock ist.
5. Verwendung Ultramikrotom erwerben Schnittserien des beschnittenen Block an der gewünschten Dicke (~ 70 nm Dicke für konventionelle TEM und ~ 250 nm Dicke zum tomographischen TEM). Kontrast in den Abschnitten mit Uranylacetat und Bleicitrat nach Standardprotokollen.

5. Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie

1. Verlagern die Zellen von Interesse indas Elektronenmikroskop unter Verwendung von Bildern in früheren Schritten erhalten. Sobald mikroinjiziert Zellen von Interesse lokalisiert wurden, verwenden Sie die hochauflösenden konfokalen Fluoreszenz-Bildern auf Regionen innerhalb der Zelle, die von Interesse waren identifizieren. Bild diese in hoher Auflösung mittels TEM. Verwenden Sie Sehenswürdigkeiten wie die Zelle Peripherie und der Kernhülle zu bestimmen, welche fluoreszierende z-Stapel-Bild auf die EM schneiden entspricht.
2. Mit der Imaging-Programm Ihrer Wahl (zB Image J, Adobe Photoshop, etc.), reduzieren Sie die Deckkraft der Fluoreszenzbild zu 50% und überlagern sie auf die TEM-Aufnahme, mit denen sie korreliert. Ausrichten der Bilder durch Anpassung der Skala (erinnern Sie Proportionen) und die Drehung des konfokalen Bild, um das TEM-Bild entsprechen. Feineinstellungen Kontrast, Schärfe, usw. in dem fluoreszierenden Bild kann in der Ausrichtung zu unterstützen. Hinweis: Wir haben festgestellt, dass Heterochromatin, die Kernhülle und die Zellperipherie eine ausgezeichnete Sehenswürdigkeiten von Beihilfe darstellenin der Ausrichtung der beiden Bilder.

6. Kritische Überlegungen

1. Stark beim Lokalisieren des injizierten kleinen Moleküls zu unterstützen, kann ein Fluoreszenz-Tag wie Rhodamin oder Fluorescein kovalent gebunden werden mit kommerziell erhältlichen Kits. Zusätzliche Informationen werden von ektopisch eine fluoreszierende subzelluläre Lokalisation Markerprotein vor Mikroinjektion gewonnen. Daher ist die Wahl der Fluorophore und inerten Mikroinjektion Markierungsfarbstoff wichtig.
2. Wählen Zellen, die für die Mikroinjektion Anhaften der Nähe des Zentrums des Deckplättchens sind und um die Wahl eines Rasters randnah. Daraufhin wird die größte Wahrscheinlichkeit, daß die Zellen von Interesse für die Epon Harz für Elektronenmikroskopie eingesetzt werden übertragen.
3. Konfluenz der Zellen iWichtig ist, wie ein voll konfluenten Platte wird Identifizierung von mikroinjizierten Zellen im Elektronenmikroskop sehr erschweren. Vielmehr Saatzellen so dass sie erreichen ~ 50% Konfluenz am Tag kurzer Experiment oder ~ 25% Konfluenz am Tag der längere (1-2 Tage) Experiment. Verwenden Sie die Position und die Form der Zellen sowie die "leeren Raum als Landmarken zur Orientierung der Elektronenmikroskopie Bild.
4. Konfokale optische Schnittdicke sollte den Bedürfnissen des Experiments abgestimmt werden und sollten deshalb empirisch ermittelt werden ^10.
5. Die Fixative Formaldehyd und Glutaraldehyd sollte von höchster Qualität zur Verfügung stehen. Formaldehyd wird fix die Zellen, aber bewahren die Fluoreszenzeigenschaften von beiden Proteinen und kleinen fluoreszierenden Moleküle (wie Rhodamin oder FITC). Es wird jedoch nicht erhalten, um die Strukturen hoher Auflösung EM erlauben. Glutaraldehyd bewahrt Membranen und subzellulären Strukturen zu einem hohen Grad für EM Analysesis, wird aber erheblich behindern Fluoreszenz. Daher ist das Zwei-Schritt-Fixierung kritischen sowohl Fluoreszenz-Mikroskopie und EM. Der Formaldehyd Fixierungsschritt kann, wenn die live-Zell-Messungen entfallen, als endgültige Fixierung durch Behandlung Glutaraldehyd durchgeführt werden kann.

7. Repräsentative Ergebnisse

Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit, ein Molekül von Interesse direkt in die eukaryotische Zytoplasma Bereitstellung und Überwachung ihrer Lokalisation und / oder Effekte auf zellulärer und organeller Architektur von Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus und das Verfahren ist in Abbildung 2 gezeigt. Diese Technik beruht auf Mikroinjektion von Zellen auf einem Laser-geätzte Glas gerasterten Deckplättchens (3A), die nach der konfokalen Mikroskopie, in der Lage ist, sowohl die interessierenden Zellen sowie das Gittermuster der Epon Resin Transfer gezüchtet (Abb.3B).

Ein typisches Mikroinjektion CLEM Verfahren ergibt Fluoreszenz-Bildern und elektronenmikroskopische Aufnahmen, die beim korreliert, ermöglichen sowohl subzellulären Lokalisation und ultrastrukturelle Analyse. Zellen auf einer gerasterten photogeätzten Glas Deckplättchens gezüchtet werden mit einem Molekül von Interesse, nach der Hellfeld-Bilder erhalten werden (Abb. 4A) mikroinjiziert. Eine inerte Markierungsfarbstoff eingebaut wird, um mikroinjizierten Zellen von nicht-mikroinjizierten Zellen (4B) zu unterscheiden. Konfokalen z-Stapel werden erhalten unter Verwendung eines Fluorophor oder eine andere Kennung an der mikroinjizierten kleines Molekül von Interesse (4C). Die Probe wird mit Glutaraldehyd fixiert und für die Elektronenmikroskopie. Elektronenmikroskopische Aufnahmen erhalten werden und auf die Zellen, denen sie entsprechen, (4D) überlagert. Bereiche beherbergen Fluoreszenzsignale werden ausführlicher in höherer Vergrößerung inspiziert (4E

Abbildung 1. Timeline der Mikroinjektion CLEM Verfahren. Je nach der Versuchsanordnung kann Mikroinjektion und Fluoreszenzmessungen am gleichen Tag vorgenommen werden. Herstellung der Probe für die Elektronenmikroskopie ist zeitaufwändigste aufgrund langer Inkubationen Schritte und dauert 2-3 Tage. TEM-Analyse und Korrelation Fluoreszenzsignale mit Elektronenmikroskopie Bilder können an einem Tag durchgeführt werden.

Abbildung 2 Allgemeine Darstellung der Mikroinjektion CLEM Schritt 1:.. Suchen wachsenden Zellen auf Laser-geätzten Glas gridded Deckglas und microinject Molekül von Interesse. Schritt 2:. Erfassung sowohl Hellfeld-Bildern und konfokale Fluoreszenz-z-Stapel mikroinjizierten Zellen Schritt 3: vorbereitenDeckglas für EM-Analyse und betten in Epon Harz. Mit transferiert Raster, Trimmblock, so dass Zellen von Interesse sind an der Spitze. Schritt 4: Schneiden Sie serielle Abschnitte mit Ultramikrotom. Schritt 5: Korrelation fluoreszierende Bilder mit EM Bildern.

. Abbildung 3 Grid-Muster erleichtert die Identifizierung von Zellen von Interesse Panel A zeigt die Mikroinjektion von Zellen gezüchtet, um ~ 50% Konfluenz;. Beachten Sie das Gitter Kennung aK. Maßstabsbalken 100 um ist. Tafel B zeigt das übertragene Gittermuster aus dem Deckglas auf dem polymerisierten Harz Epon Block, sektioniert wird seriell hinter das Gitter von Interesse in einer Dissektionsmikroskop identifiziert wird. Tafel C zeigt das übertragene Gittermuster in Vorbereitung zur Sektionierung . Beachten Sie, dass die übertragenen Grid patter in umgekehrter auf dem Harz Block; scale Bar ist 1200 um.

.. Abbildung 4 Repräsentative Ergebnisse aus Mikroinjektion korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie Panel A zeigt die Hellfeld-Aufnahme NRK wachsenden Zellen auf einem Laser-geätzten Glas gridded Deckglas; Pfeile zeigen zwei Zellen, visualisiert durch CLEM in Platten CD sind Panel B zeigt die Fluoreszenz. des inerten Markierungsfarbstoff, in diesem Fall Cascade Blue, verwendet wurden, um Zellen zu identifizieren, mikroinjiziert. Tafel C zeigt die Überlagerung von Hellfeld und die Fluoreszenz Signatur eines Rhodamin-markierte kleine Molekül. Die beiden Zellen sind hier dargestellt durch Pfeile in Abb. A & B. Tafel D darstellt CLEM von Hellfeld, fluoreszierenden und Elektronenmikroskopie ergab;. Pfeilspitze zeigt fluoreszierenden puncta abzubildenden bei höheren Vergrößerung im Panel E Maßstabsbalken sind wie folgtTiefen: Panels A & B, 100 &mgr; m; C & D, 50 um; E, 100 nm.

Discussion

Das hier vorgestellte Verfahren ermöglicht die direkte Abgabe des gereinigten Proteinen, Nukleinsäuren, oder kleinen Molekülen an die eukaryotischen Zytoplasma und liefert ultrahochauflösende Analyse durch die Korrelation von fluoreszierenden und Elektronenmikroskopie. Die Anwendung dieser Methode ist einfach, aber robust und kann in-house mit vielen bestehenden Core Facilities und / oder entsprechend ausgestattete Elektronenmikroskopie Labors durchgeführt werden. Die Technik eignet sich auch, um Live-Zelle, so dass der...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Fotoätzteile Coverslip und Live-cell Platte	MatTek	P35G-2-14-CGRD
Texasrot	Invitrogen	D3329
Cascade Blue	Invitrogen	D7132
Rhodamin Labeling Kit	Thermo Scientific	53002
0,22 um Zentrifugalfiltration Einheit	Millipore	UFC30GV00
Borosilikatglas Pipetten	Sutter Instruments	BF100-50-10
Feinpipettenziehvorrichtung	Sutter Instruments	Modell P-97	Mit dem Programm # 4 nach Durchführung Ramp Test
FemtoJet Mikroinjektions-System	Eppendorf	InjectMan NI2
Coverslip Removal Flüssigkeit	MatTek	PDCF OS 30
Technai Transmission Electron Microscope	FEI	Technai G2 BioTWIN
Ultramicrotombe	Leica	EM UC6