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Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

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DOI:

10.3791/3655

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10. Januar 2012

 , 
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine neuartige High-Throughput-Verfahren beschrieben, die ermöglicht den Nachweis und die relative Quantifizierung von kleinen RNA-und mRNA-Expression von einzelnen Bakterienzellen Verwendung gesperrt Nukleinsäure-Sonden und Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung.

Zusammenfassung

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine leistungsfähige Technik, die zur Erkennung und Lokalisierung von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in der zellulären Umgebung ist. Um den Durchsatz zu erhöhen, können FISH mit Durchflusszytometrie (flow-FISH) kombiniert werden, um den Nachweis von gezielten Nukleinsäuresequenzen in Tausenden von einzelnen Zellen zu ermöglichen. Als Ergebnis bietet Flow-FISH einen entscheidenden Vorteil gegenüber Lysat / Ensemble-basierten Nukleinsäure-Nachweisverfahren, weil jede Zelle als eine unabhängige Beobachtung behandelt wird, wodurch eine stärkere statistische und Abweichungsanalysen. Diese Attribute haben die Verwendung von FISH und Flow-FISH-Methoden in einer Reihe von verschiedenen Anwendungen aufgefordert werden, und den Nutzen dieser Methoden wurde erfolgreich in Telomerlänge Bestimmung 1,2, zelluläre Identifikation und Genexpression 3,4 nachgewiesen, Überwachung Virusvermehrung in infizierten Zellen 5 und bakterielle Gemeinschaft Analyse und Zählung6.

Traditionell wurde die Spezifität der FISH-und Flow-FISH-Methoden von DNA-Oligonukleotid-Sonden wurden vermittelt. Kürzlich hat jedoch der Austausch von DNA-Oligonukleotid-Sonden mit Nukleinsäure-Analoga wie FISH und Flow-FISH-Sonden sowohl die Sensitivität und Spezifität der jeweiligen Technik aufgrund der höheren Schmelztemperaturen (T m) dieser Analoga für natürlichen Nukleinsäuren 7,8 erhöht . Locked Nucleic Acid (LNA)-Sonden sind eine Art von Nukleinsäure-Analogon, das LNA Nukleotide in einem DNA-oder RNA-Sequenz 9,10 aufgestockt. Wenn es mit Flow-FISH gekoppelt haben LNA-Sonden zuvor gezeigt, dass konventionelle DNA-Sonden 7,11 übertreffen und wurden erfolgreich eingesetzt, um eukaryotische mRNA 12 und virale RNA in Säugetierzellen 5 zu erfassen.

Hier erweitern wir diese Fähigkeit und beschreiben eine LNA Flow-FISH-Methode, die den spezifischen Nachweis von RNA ermöglicht in Bakterienzelles (Abbildung 1). Insbesondere sind wir in der Detektion von interessierten kleine nicht-kodierende regulatorische RNA (sRNA), die sammelte großes Interesse in den letzten Jahren haben, wie sie gefunden wurden, um als wichtige regulatorische Elemente in vielen kritischen zellulären Prozessen 13 dienen. Allerdings gibt es begrenzte Werkzeuge, um sRNAs und die Herausforderungen zu erkennen sRNA in Bakterienzellen Studie ist zum Teil aufgrund der relativ geringen Größe (typischerweise 50-300 Nukleotide lang) und eine geringe Menge von sRNA Moleküle sowie die generelle Schwierigkeit in der Arbeit mit kleineren biologischen Zellen mit verschiedenen zellulären Membranen. Bei dieser Methode beschreiben wir Fixierung und permeabilzation Bedingungen, die die Struktur der bakteriellen Zellen zu erhalten und ermöglichen das Eindringen von LNA-Sonden sowie Signalverstärkung Schritte, die den spezifischen Nachweis von geringen Mengen vorhandenen Srna (Abbildung 2) zu ermöglichen.

Protokoll

1. LNA-Sonden und experimentelles Design

  1. Design-LNA-Sonden, die die umgekehrte Ergänzung Ihres transkribiert sRNA / mRNA sind oder sie an kundenspezifische www.exiqon.com . Wenn Sie die benutzerdefinierte Design-Option, werden Sie wissen, die Reihenfolge, nicht aber die LNA spiking Muster. Die Zugabe von jeweils LNA Rückstand in eine DNA-oder RNA-Oligonukleotid führt zu einem Anstieg in T m zwischen zwei und 10 ° C für eine LNA-RNA-Hybridisierung Duplex-14. Idealerweise sollte die entworfen LNA-Sonden zwischen 20-25 Nukleotide lang (länger Sonden sind schwieriger zu synthetisieren) sein und eine T m zwischen 85-90 ° C für die RNA-Hybridisierung.
  2. Nach dem Entwurf der Sequenz verwenden BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi oder vergleichen Sie die Sondensequenz auf Ihre lokale Datenbank, um sicherzustellen, wird die Sonde spezifisch nur auf Ihre sRNA / mRNA des Interesses.
  3. Bei der Bestellung der LNA-Sonde, fügen Sie ein Biotin-TEG Modifikation der 5 'Ende der LNA-Oligonukleotid. Die Biotinylierung ist notwendig für Post-Hybridisierung Färbung mit einem Streptavidin-Farbstoff-Konjugat. Es ist möglich, diese Modifikation zu den 3 Add 'end if notwendig, aber die zusätzlich zu den 5' Ende ist weniger teuer und sollte in höheren Ausbeuten führen.
  4. Drei negative Kontrollen sollten in das Verfahren einbezogen werden: (i) a 'no LNA' control, in dem ein LNA-Sonde nicht während der Hybridisierung wird hinzugefügt, (ii) ein "Nein Farbstoff der Kontrolle, in dem der LNA-Sonde ist es, die hybridisierten Ziel sRNA aber die Hybridisierung Veranstaltung ist nicht durch das Fehlen des fluoreszierenden Fleck, erkannt und (iii) ein "Nicht-Ausdruck sRNA / mRNA-Steuerelement, das ein LNA-Sonde, die eine nicht vorhandene oder nicht ausgedrückt sRNA, um Ziele nutzt Nicht-spezifische Hybridisierung zu überwachen.
  5. Die spezifischen LNA-Sonde hier ist komplementär zu den sRNA CsrB und hat die Sequenz 5'-Biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(LNA Monomeren inGroßbuchstaben).
  6. Nach Erhalt der lyophilisierten LNA, mit Nuklease-freiem Wasser auf 50 pg / mL und speichern resuspendieren in 10-20 ul Aliquots bei -20 ° C.

Lösungen

  • 8% paraformaldehye (PFA), 10% Essigsäure in PBS: Mix 1 mL 32% pfa, 400 ul Essigsäure, 400 ul 10X PBS, pH = 7,4 und 2,2 ml Nuklease-freies Wasser. Für gefrorenen Aliquots, in einmaligen Gebrauch bei -20 ° C ohne Essigsäure einfrieren.
  • 60% Dextransulfat-Lösung: add 6,0 ​​g Dextransulfat zu einem 50 ml konischen Röhrchen und Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 mL. Hitze dieses Gemisch auf 65 ° C in einem Wasserbad, bis die Dextransulfat gelöst ist (konnte 1-2 Stunden dauern). Zusätzliches Wasser Möglicherweise müssen Sie während der Solubilisierung hinzugefügt werden, um eine 10 ml Volumen zu erhalten. Aliquot der 60% Dextransulfat-Lösung und bei -20 ° C bis zur Verwendung.

2. Fixierung

  1. Ernte 1x10 8 Zellen der Biolumineszenz Vibrio campbellii oder Ihre Bakterien von Interesse und übertragen Sie sie in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. Diese Menge von Zellen bietet genügend Ausgangsmaterial für vier Flow-FISH-Proben (eine bestimmte LNA-Sonde Probe und drei negative Kontrollen). Zusätzliche 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Aliquots sollten dann erhoben, wenn andere sRNA / mRNA-Spezies getestet werden müssen.
  2. Pellet die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 2300 xg für 5 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette, und Zellen in 400 ul 1X PBS.
  3. Zu dieser Mischung werden 400 ul einer 8% paraformaldehye (pfa) und 10% Essigsäure in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (1X PBS), gut mischen und inkubieren für 10 Minuten bei 25 ° C Mischen einmal nach fünf Minuten. Alle Inkubationen, sofern nicht anders angegeben, sind in einem beheizten Rohr Halter durchgeführt. Die pfa Lösung sollte frisch zubereitet werden oder verwendet werden von gefrorenen Aliquots nach der Zugabe von Essigsäure. Paraformaldehyd ist ein Vernetzer Fixativ, dass hELPS zu bewahren Zellmorphologie und behalten intrazellulären RNA.
  4. Pellet die Zellen aus diesem Gemisch durch Zentrifugation bei 4500 xg für 2 Minuten und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Alle künftigen Schritte, die Zentrifugation benötigen, sollten die gleichen Einstellungen (7K, 2 min). Es ist wichtig, dass nach Zentrifugation beachten Sie die Überstände durch Pipettieren und Dekantieren nicht entfernt werden sollte.
  5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 400 ul 1X PBS resuspendieren und die endgültige Zellpellet in 400 ul 1X PBS. Die Zellen sind nun behoben und kann bei 4 ° C in 400 ul 1X PBS für bis zu sieben Tage gelagert werden.

3. Diethylpyrocarbonat Behandlung

  1. Bereiten Sie 400 ul einer 0,1% igen Lösung von Diethyl-(DEPC) in 1X PBS (400 ul dieser Lösung ist für jede zu untersuchende Probe so Skala entsprechend werden benötigt). Die DEPC-Lösung sollte frisch zubereitet von einem DEPC Lager sein. DEPC-Behandlung inaktiviert RNasen durch carbethoxylation und verringert dieHintergrund-Signal.
  2. Zugabe von 400 ul der 0,1% DEPC-Lösung in jede feste Bakterienzelle Probe und mischen Sie gut durch Pipettieren. Inkubieren dieser Mischung bei 25 ° C für 12 Minuten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 400 ul 1X PBS, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand.

4. Permeabilisierung

  1. Add 1,0 mg Lysozym auf 1 ml Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) für eine 1,0 mg / ml Lösung. Diese Lösung sollte frisch zubereitet werden. Add 800 ul der 1 mg / mL Lysozym-Lösung zu den Zellen, mischen durch Pipettieren und Inkubieren bei 25 ° C für 30 Minuten unter gelegentlichem Mischen. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Lysozym wirkt als Permeabilisierung Reagenz durch Hydrolyse der Peptidoglycan in bakteriellen Zellwänden.
  2. Bereiten Sie eine 3,0 pg / ml-Lösung von Proteinase K in TE-Puffer. Diese Lösung sollte hergestellt aus einer 20 mg / ml Proteinase K Aktie, die bei -20 ° C gelagert wird frischProteinase K ist eine Serin-Protease, die eine Vielzahl von Proteinen verdaut und hilft die Zugänglichkeit der Sonden und Reagenzien an die RNA.
  3. Add 800 ul des 3,0 ug / ml Proteinase K-Lösung auf das Zellpellet und gründlich durch Pipettieren. Inkubation bei 25 ° C für 15 Minuten mit Vortexen auf halbem Weg durch die Inkubation.
  4. Pellet der Zellen (7K, 2 min), entfernen Sie den Überstand und die Zellen werden einmal mit 400 ul 1X PBS. Nach dem Entfernen der Wäsche Überstand, die Zellen in 400 ul 1X PBS und 100 ul der Resuspension in vier neue 1,5 ml Reaktionsgefäße. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand.

5. Hybridisierung

  1. Bereiten Sie 100 ul Hybridisierungspuffer (HB) für jede Probe. Das HB ist von 50% Formamid nach Volumen, 10% Dextransulfat Masse (add 16,7 ul der 60% Dextransulfat-Lösung für alle 100 ul), 1X Denhardt-Lösung, 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 gestellt,2X Natriumcitrat (SSC), 20 ug gescherte Lachssperma-DNA (SSSD) und 20 ug Hefe-tRNA.
  2. Jede der Komponenten des HB hat einen anderen Zweck. Formamid senkt die Schmelztemperatur von Nukleinsäureduplexe dabei helfen, mit Denaturierung der RNA und die Minimierung von Zellschäden. Dextransulfat ist als Volumen-ohne Polymer, um die Sonde zu konzentrieren und steigern die Hybridisierung Rate verwendet. Denhardts Lösung, Hefe-tRNA und SSSD als Blocker dienen, um unspezifische Bindung zu reduzieren.
  3. In jedem der Zelle Resuspension-Gehalt von 1,5 mL Reaktionsgefäße, fügen Sie 95 ul HB und 5,0 ul der sRNA / mRNA-spezifische LNA [20 pmol der spezifischen LNA Endkonzentration] oder Wasser (für die keine LNA Negativ-Kontrolle). Zum Beispiel:
    1. Rohr 1 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA / mRNA-spezifische Sonde
    2. Rohr 2 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA / mRNA-spezifischen Sonde ("kein Farbstoff" Negativ-Kontrolle)
    3. U-Bahn 3 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA/ MRNA-Sonde ("non-Ausdruck sRNA / mRNA" Negativ-Kontrolle)
    4. Rohr 4 bis 95 ul HB + 5,0 ul Wasser ('no LNA "Negativ-Kontrolle)
  1. Inkubieren Sie alle vier Proben bei 60 ° C für 60 Minuten. Die Hybridisierung ist abhängig von der LNA-Sonde (n) T m und sollte bei ca. 30 ° C eingestellt werden unterhalb der prognostizierten T m für die RNA-Glühen. Sowohl die erhöhte Hybridisierungstemperatur und Formamid im HB sorgt für die Denaturierung von Sekundärstruktur des sRNA oder mRNA des Interesses.

6. Post-Hybridisierung wäscht

  1. Nach der Hybridisierung 1,0 ml 0,1 × SSC mit 0,1% Tween-20 (SSCT), um die Hybridisierung Mischung. Dies ist notwendig, damit die Zellen aus der zähen Hybridisierungslösung entfernt werden. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand.
  2. Geben Sie 200 ul von 50% Formamid, 2X SSC, 0,1% Tween-20, die Zellpellets, gründlich mischen und incubaß für 30 Minuten bei 65 ° C in einem Heizblock.
  3. 1 ml 0,1 × SSCT auf die Mischung, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand.
  4. Add 500 ul 0,1 X SSCT, um die Zellen zu resuspendieren, Inkubation für 40 Minuten bei 65 ° C in einem Heizblock. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand.

7. Blocking und Färbung

  1. Bereiten Sie die Blocking-Puffer (BB) und die Streptavidin-Farbstoff-Färbelösung. Bereiten Sie eine 1X BB-Lösung aus einer 5fach-Aktie (im Handel erhältlich, siehe Reagenzien). Für jede Gruppe von vier Röhren, bereiten 1,2 ml 1X BB.
  2. Geben Sie 200 ul 1X BB auf die Zellpellets, resuspendieren und Inkubation für 30 Minuten bei 25 ° C.
  3. Ein Streptavidin-konjugierten Farbstoff wird verwendet, um die biotinylierten LNA-Sonden erkennen. Während blockieren, bereiten eine Lösung von 2 pg / mL DyLight 488 Streptavidin oder die gewünschte Farbstoff-Streptavidin-Konjugat in 1X BB für 30 min (für drei Proben, machen 300 ul).
  4. Nach incubarbeit mit 1X BB-, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Dann werden 50 ul der Streptavidin-Farbstoff-Lösung, die Zellpellets, mischen und inkubieren für 12 Minuten bei 25 ° C unter ständigem Mischen auf einem Vortex oder in einem Thermomixer. Für die "keinen Farbstoff der Kontrolle, mit 50 ul 1X Blockierungspuffer nur. Für den Rest des Protokolls zum Schutz der Rohre von Licht mit Aluminiumfolie.
  5. Waschen Sie die Zellen einmal mit 500 ul 0,1 X SSCT Puffer und einmal mit 400 ul 1X PBS mit 0,1% Tween-20 (PBST). Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand.
  6. Nach der ersten Streptavidin-Konjugat-Färbung, wird das Signal durch die Einführung eines biotinylierten Anti-Streptavidin Antikörpers an die Streptavidin-Farbstoff-Konjugat und dann Färbung ein zweites Mal mit dem Streptavidin-Farbstoff erhöht so die Signalausgabe pro hybridisierte LNA-Sonde (Abbildung 2) verstärkt .
  7. Geben Sie 100 ul von 1 pg / mL biotinylierten Anti-Streptavidin-Antikörper in 1X PBS, resuspend die Zellen, und Inkubieren bei 25 ° C für 30 Minuten unter gelegentlichem Mischen. Pellet der Zellen (7K, 2 min), entfernen Sie den Überstand und waschen zweimal mit 400 ul 1X PBST.
  8. Dann werden 50 ul der 2 pg / mL Streptavidin-Farbstoff-Lösung zu den Zellen, mischen und inkubieren für 12 Minuten bei 25 ° C unter ständigem Mischen auf einem Vortex oder in einem Thermomixer. Für die "keinen Farbstoff der Kontrolle, mit 50 ul 1X Blockierungspuffer nur.
  9. Waschen Sie die Zellen einmal mit 500 ul 0,1 X SSCT Puffer und einmal mit 400 ul 1X PBST.
  10. Resuspendieren der Zellen in 200 ul 1X PBST und lagern bei 4 ° C, bis sie zur Durchflusszytometrie. Für kleinere Bakterienzellen stellen Sie den Durchfluss zu langsam, um den Kern verkleinern. Darüber hinaus ist für Durchflusszytometer mit Vorwärtsstreuung Schwelle Abschaltungen, muss die Grenzfrequenz so niedrig wie möglich eingestellt werden, um sicherzustellen, dass die kleinen bakteriellen Zellen erkannt werden.
  11. Für DyLight 488 Erkennung, sollte das Durchflusszytometer mit einem 488 nm Laser-und Standard-Emission ausgestattet werdenFilter für FITC. Mindestens 2x10 4 Ereignisse gesammelt werden sollten. Um die Kompatibilität mit Durchflusszytometer mit verschiedenen Lasern ausgestattet ist, können andere Streptavidin-konjugierte Fluorophore für dieses Protokoll verwendet werden.

8. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für Zellen, die fixiert und permeabilisiert effektiv in der Durchflusszytometrie Dot-Plot in Abbildung 3A gezeigt. Bei Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen zur Permeabilisierung ist die Zellpopulation kleine und homogene zeigt einige Zellaggregate. Bei höheren (5 mg / ml) Konzentrationen von Lysozym verwendet werden, werden die Zellen mit größerer Wahrscheinlichkeit zu aggregieren und zu zeigen erhöhte Vorwärtsstreuung Werte indikativ für größere Partikel (Abbildung 3B). Ein Beispiel für die Durchflusszytometrie Daten aus einer erfolgreichen LNA Flow-FISH Experiment ist in Abbildung 4 dargestellt. Das Histogramm zeigt die spezifische Detektion eines Targets sRNA zusammen mit drei negativen Kontrollen.Die "keinen Farbstoff" Negativ-Kontrolle produziert am wenigsten Fluoreszenz, die von der 'no LNA "und" non-Ausdruck sRNA "negativen Kontrollen folgen. Schließlich erzeugt der Probe mit dem sRNA-spezifische LNA-Sonde der größte Fluoreszenz. Sobald die Methode und LNA-Sonden auf diese Weise validiert sind, können zusätzliche Experimente entwickelt, um Veränderungen in der sRNA Signals über die Zeit zu überwachen, in Reaktion auf Mutationen oder vielfältige Kultur Bedingungen, etc.

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Abbildung 1. Darstellung des Gesamtkonzepts eines LNA Flow-FISH Experiment zum Nachweis von bakteriellen sRNA.

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Abbildung 2. Färbung und Verstärkung des LNA Flow-FISH-Signal. a) Hybridisierung der biotinylierten LNA-Sonde. b) Färbung mit dem fluoreszierenden DyLight 488 Streptavidinkonjugat. c) Die Bindung des biotinylierten anti-streptavidin Antikörpers an die DyLight 488 Streptavidin. Der Antikörper kann Streptavidin durch seine Antigen-Bindungsstelle binden oder durch Streptavidin durch seine Biotin-Reste gebunden zu sein. d) Verstärkung des Signals durch weitere Färbung mit dem Fluoreszenz-DyLight 488 Streptavidinkonjugat.

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Abbildung 3. Durchflusszytometrie Dot-Plots zeigen uns gegenüber side scatter Ergebnisse für a) 1 mg / mL Lysozym, 3 pg / mL Proteinase K Permeabilisierung und b) 5 mg / ml Lysozym, 3 pg / ml Proteinase K Permeabilisierung.

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Abbildung 4. Histogramm Analyse der LNA Flow-FISH Ergebnisse. Das Fluoreszenzsignal von jeder Probe erzeugt wird durch die vier Spuren gezeigt: schwarz - sRNA-spezifische LNA-Sonde, rot - "nicht zum Ausdruck sRNA" negative Kontrolle; blau - 'no LNA "negative Kontrolle; purple -'Keinen Farbstoff "negative Kontrolle.

Diskussion

Der LNA Flow-FISH-Methode vorgestellt wurde hier verwendet, um den Ausdruck einer sRNA aus dem Gram-negative marine Bakterium Vibrio campbellii deren Expression zuvor via Microarray-basierte Expression Profiling und Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion 16 geschlossen wurde bestätigt zu erkennen. Bis heute haben wir diese Methode verwendet, um die Expression einer Vielzahl von RNAs (zB trans-codierte sRNA, sRNA, dass Protein-Aktivität, Riboschalter und mRNA modulieren) zu überwachen. Als solche sind wir zuversichtlich, dass die Methode anpassungsfähig und kann verwendet werden, um sRNA oder mRNA Ziel zu erkennen und können für die Verwendung in allen Bakterienarten oder Zelltyp modifiziert werden können. Wenn Änderung dieses Protokolls ist die für andere Zelltypen, ist die wichtigste Variable zu berücksichtigen Manipulation der Permeabilisierung Schritt. Zum Beispiel bei der Änderung der Permeabilisierung hier beschriebenen Bedingungen, sollten Veränderungen in den Konzentrationen von Lysozym und Proteinase K getestet werden. Wir fanden, dass eine Verdoppelung oderVerdreifachung der Menge an Lysozym und Proteinase K führte zu großen Veränderungen in der LNA Flow-FISH Ergebnisse. Darüber hinaus bei der Prüfung von zusätzlichen Permeabilisierung Bedingungen sollte der Zellen für die Verklumpung, Zellverlust, und die beste erhältliche Signal an Hintergrundfluoreszenz Verhältnis analysiert werden. Das Ausmaß der Zelle Verklumpung kann durch Mikroskopie und / oder Durchflusszytometrie getestet werden. Mit der Durchflusszytometrie sind Zellklumpen Gegenwart als Schwänze in einer Vorwärts-vs side scatter Dot-Plot und die richtige Methode Permeabilisierung diesem Tailing-Effekt zu minimieren. Diese Methode eignet sich auch für Multiplex sRNA Erkennung ohne größere Änderungen an den beschriebenen Protokolls als Zusatzartikel LNA-Sonden mit anderen Haptene wie Digoxigenin während der Hybridisierung hinzugefügt werden könnten und dann mit einem Anti-Digoxigenin-Antikörper und sekundären Antikörper-Fluorophor-Konjugat nachgewiesen. Derzeit ist die einzige Einschränkung, dass wir mit dieser Methode kennengelernt haben ihre Unfähigkeit, eine ausreichende Signal schwach ex erzeugengedrückt sRNA Arten und Bemühungen sind im Gange, um die Nachweisgrenze zu bestimmen (in absoluten Kopienzahl pro Zelle).

Insgesamt bietet die LNA Flow-FISH-Methode die Möglichkeit, bakterielle sRNA oder mRNA-Expression bei den einzelnen Zell-Ebene in einem hohen Durchsatz Weise Erkenntnisse über das Vorhandensein und die relative Häufigkeit eines sRNA Arten und das Ausmaß, die ihren Ausdruck variiert bieten messen in einer Population.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Office of Naval Research über US Naval Research Laboratory Kern Mitteln gefördert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
10X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 Applied Biosystems / Ambion AM9625
Nuklease-freies Wasser Applied Biosystems / Ambion AM9932 (Nicht DEPC behandelt)
32% Paraformaldehyd Electron Microscopy Sciences RT 15714 Ethanol frei
Essigsäure Acros Organics 327290010
Diethyl (DEPC) Sigma Aldrich D5758 Keep ausgetrockneten
Lysozym Sigma Aldrich L2879
Proteinase K (20 mg / mL) Applied Biosystems / Ambion AM2546
Formamid Applied Biosystems / Ambion AM9342 Entionisiertes aliquotieren und einfrieren
Dextransulfat MW> 500.000 Sigma Aldrich D8906 Aliquot 60% ige Lösung und frieren
Denhardt-Lösung 50X-Konzentrat Sigma Aldrich D2532 Aliquotieren und einfrieren
Natriumcitratpuffer 20X Applied Biosystems / Ambion AM9770
Lachssperma DNA (geschert) 10 mg / mL Applied Biosystems / Ambion AM9680 Aliquotieren und einfrieren
Hefe tRNA (10 mg / mL) Life Technologies / Invitrogen 15401-011 Aliquotieren und einfrieren
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
5x in-situ-Hybridisierung Blockierungslösung Vector Laboratories MB-1220
DyLight 488 Streptavidin Vector Laboratories SA-5488-1
Biotinylierten Anti-Streptavidin Vector Laboratories BA-0500 Aliquotieren und einfrieren

Referenzen

  1. Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).
  2. Lansdorp, P. M. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).
  3. Pernthaler, A., Amann, R. Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).
  4. Jen, C. J. Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).
  5. Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH. RNA. 16, 1679-1685 (2010).
  6. Friedrich, U., Lenke, J. Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).
  7. Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11, 1745-1748 (2005).
  8. Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers. Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).
  9. Obika, S. Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering. Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).
  10. Koshkin, A. A. LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).
  11. Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes. Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).
  12. Robertson, K. L., Thach, D. C. LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes. Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).
  13. Waters, L., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136, 615-628 (2009).
  14. Petersen, M., Wengel, J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).
  15. Corput, M. P. C. vd, Grosveld, F. G. Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells. Methods. 25, 111-118 (2001).
  16. Silveira, A. C. G. Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios. Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).

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Schlagwörter

LNA SondenRNA ExpressionsanalyseZellfixierung und permeabilisierungSignalverst rkungsschritteFlow FISH MethodeNukleins ure Analog Sonden

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