Mame Modeller för 4D Live-cell imaging av tumör: mikromiljö Interaktioner som påverkar malign progression
Summary
Vi har utvecklat 3D samkultursystem modeller för live-cell imaging i realtid av interaktioner mellan brösttumörceller och andra celler i deras mikromiljö som påverkar utvecklingen till en invasiv fenotyp. Dessa modeller kan tjäna som prekliniska skärmar för läkemedel att rikta parakrin-inducerade proteolytiska, kemokin / cytokin och kinas vägar som är inblandade i invasivitet.
Abstract
Vi har utvecklat 3D samkultursystem modeller, som vi kallar MAME (m ammary en rchitecture och m icroenvironment e ngineering), och använde dem för live-cell imaging i realtid av cell: cell interaktioner. Vårt övergripande mål var att utveckla modeller som rekapitulera arkitektur preinvasive bröstförändringar att studera deras utveckling till en invasiv fenotyp. Specifikt har vi utvecklat modeller för att analysera växelverkningar mellan premaligna bröstepitelialceller cellvarianter och andra celltyper i tumören mikromiljö som har implicerats i förstärka eller reducera framskridandet av preinvasive bröst epitelceller till invasivt duktalt karcinom. Andra celltyper studerats hittills är myoepiteliala celler, fibroblaster, makrofager och blod och lymfatiska mikrovaskulära endotelceller. Förutom de Mame modeller, vilka är utformade för att sammanfatta de cellulära interaktioner inom bröstet undercancerprogress har vi utvecklat jämförbara modeller för progression av prostatacancer.
Här illustrerar vi de förfaranden för fastställande av 3D samodlingarna tillsammans med användning av live-cell imaging och en funktionell proteolys analys att följa övergången av samodlingar av bröst duktal cancer in situ (DCIS) celler och fibroblaster till en invasiv fenotyp över tiden, i detta fall över 20-tre dagar i odling. Den MAME samodlingar består av flera skikt. Fibroblaster är inbäddade i det undre skiktet av typ I kollagen. På att placeras ett skikt av rekonstituerat basalmembran (RBM) på vilken DCIS celler sås. En slutlig översta lagret av 2% RBM ingår och fylls med varje byte av media. Att avbilda proteolys associerad med progression till en invasiv fenotyp, använder vi färgämne-kylda (DQ) fluorescerande matrisproteiner (DQ-kollagen I blandas med skiktet av kollagen I-och DQ-kollagen IV blandades med mellanskiktet av rBM) och observera levande kulturer med användning av konfokalmikroskopi. Optiska sektioner fångas, bearbetas och rekonstrueras i 3D med Volocity visualiseringsprogram. Under loppet av 23 dagar i MAME samodlingar, de DCIS celler prolifererar och sammansmälter till stora invasiva strukturer. Fibroblaster migrera och blir införlivade i dessa invasiva strukturer. Fluorescerande proteolytiska fragment av kollagener återfinnes i association med ytan av DCIS strukturer, intracellulärt, och även dispergeras i hela den omgivande matrisen. Läkemedel som riktar proteolytisk, kemokina / cytokin och kinas vägar eller modifieringar i den cellulära sammansättningen av samodlingarna kan minska invasivitet, vilket antyder att Mame modeller kan användas som prekliniska skärmar för nya terapeutiska tillvägagångssätt.
Protocol
Discussion
Som framgår kan MAME samodlingarna användas för live-cell imaging i realtid av interaktioner mellan de olika cellulära komponenter som utgör en brösttumör och dess mikromiljö. I pågående studier i vårt laboratorium har vi använt MAME samodlingarna att identifiera proteolytiska vägar i samband med övergång från DCIS till invasiv duktal cancer, som liksom samspelet mellan proteolytiska vägar och andra vägar är inblandade i denna övergång som kemokiner / cytokin / tillväxtfaktor vägar . Vi visade vid…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS och RRM). Live-cell imaging utfördes i Mikroskopi, Imaging och Cytometry stöd Resources Core, delvis av NIH Center bidrag P30 CA22453 till Karmanos Cancer Institute, Wayne State University och av Perinatology Research förgrena sig av National Institutes of Child Health och utveckling , Wayne State University.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) |
Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-col IV D12052 |
|
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific Co. | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza | MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 |
Phenol red–free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
Referenzen
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
