Modèles de MAME pour 4D imagerie des cellules vivantes de la tumeur: Interactions microenvironnement Progression impact malin

Résumé

Nous avons développé des modèles 3D pour coculture imagerie des cellules vivantes en temps réel des interactions entre cellules tumorales mammaires et d'autres cellules dans leur microenvironnement que la progression d'impact à un phénotype invasif. Ces modèles peuvent servir d'écrans précliniques de médicaments afin de cibler paracrine induites par les voies protéolytiques, des chimiokines / cytokines et de la kinase impliqués dans envahissant.

Résumé

Nous avons développé des modèles 3D coculture, que nous appelons MAME (m ammary une rchitecture et m icroenvironment e NGÉNIERIE), et les a utilisés pour imagerie des cellules vivantes en temps réel de la cellule: les interactions cellulaires. Notre objectif global est de développer des modèles qui récapitulent l'architecture des lésions mammaires préinvasives d'étudier leur progression vers un phénotype invasif. Plus précisément, nous avons développé des modèles pour analyser les interactions entre les variantes du sein pré-malignes de cellules épithéliales et d'autres types cellulaires de l'microenvironnement de la tumeur qui ont été impliqués dans l'amélioration ou la réduction de la progression des cellules mammaires épithéliales préinvasives à des carcinomes canalaires invasifs. D'autres types cellulaires étudiés à ce jour sont des cellules myoépithéliales, les fibroblastes, les macrophages et les cellules sanguines et endothéliales lymphatiques microvasculaires. En plus des modèles de MAME, qui sont conçus pour récapituler les interactions cellulaires dans le sein au cours dela progression du cancer, nous avons développé des modèles comparables de la progression de cancers de la prostate.

Ici, nous illustrons les procédures d'établissement des cocultures 3D avec l'utilisation de l'imagerie des cellules vivantes et un dosage de la protéolyse fonctionnelle de suivre la transition de cocultures de cancer du sein canalaires in situ (CCIS) des cellules et des fibroblastes à un phénotype invasif dans le temps, ce cas plus de vingt-trois jours de culture. Le cocultures MAME constitués de couches multiples. Fibroblastes sont noyées dans la couche inférieure de collagène de type I. Qui est placé sur une couche de membrane basale reconstituée (RBM) sur lequel les cellules sont ensemencées CCIS. Une couche supérieure finale de la GAR 2% est inclus et réapprovisionné à chaque changement de médias. Pour la protéolyse image associée à la progression vers un phénotype invasif, nous utilisons colorant trempés (DQ) fluorescentes protéines de la matrice (DQ-collagène de type I en mélange avec la couche de collagène de type I et DQ-collagène IV mélangée avec la couche intermédiaire de RBM) et d'observer les cultures vivantes en utilisant la microscopie confocale. Sections optiques sont capturés, traités et reconstruit en 3D avec un logiciel de visualisation Volocity. Au cours de 23 jours en cocultures MAME, les cellules prolifèrent et CCIS se fondent en de grandes structures envahissantes. Les fibroblastes migrent et sont incorporés dans ces structures envahissantes. Fluorescentes des fragments protéolytiques de les collagènes sont trouve en liaison avec la surface des structures CCIS, intracellulairement, et également dispersé dans la matrice environnante. Drogues que les voies protéolytiques cible, chimiokines / cytokines et de la kinase ou des modifications dans la composition cellulaire de la cocultures peut réduire le caractère invasif, ce qui suggère que les modèles de MAME peut être utilisé comme écrans précliniques pour de nouvelles approches thérapeutiques.

Protocole

1. Préparer DQ-substrats

1. Laisser lyophilisé DQ-substrats se réchauffer à température ambiante avant ouverture des flacons, préparer la solution stock de 1 mg / ml de DQ-substrat dans de l'eau déminéralisée, divisez en 50 aliquotes et conserver à 4 ° C.

Il peut être nécessaire pour agiter DQ-substrat dans un bain d'eau à ultrasons pour ~ 5 min et de la chaleur à 50 ° C pour faciliter la dispersion.

2. FrP dégel sur la glace durant la nuit à 4 ° C; FrP doivent être manipulés sur la glace en tout temps.
3. Pour faire phosphate 10X solution saline tamponnée (PBS), dissoudre 80 g de NaCl (1,37 M), 2 g de KCl (0,027 M), 14,4 g de Na ₂ HPO ₄ (1 M), et 2,4 g de KH ₂ PO ₄ (0,02 M) dans 800 ml d'eau ultra-pure. Ajuster le pH de la solution tampon PBS à 7,4 avec 1,0 M de HCl. Amener le volume à 1 litre, stériliser par filtration.
4. Préparer collagène de type I solution sur la glace: 8 pièces de collagène I réfrigérés pour 1 partie d'eau glacée PBS 10X. Ajuster le pHde mélange à l'aide 7.2 à 7.6 stérile 0,1 M de NaOH. Vérifier le pH avec des bandes de pH et ajuster le volume final à 10 parties avec de l'eau stérile.
5. Préparer DQ-collagène I: matrice collagène de type I par dilution DQ-collagène I dans collagène I solution dans un tube refroidies à une concentration finale de 25 pg / ml et 2,4 mg / ml, respectivement.
6. Préparer DQ-collagène IV: membrane basale reconstituée (RBM) en diluant la matrice DQ-collagène IV dans FrP (Cultrex ou Matrigel) dans un tube à refroidies une concentration finale de 25 pg / ml et 12-15 mg / ml, respectivement. Mélanger sur la glace en utilisant un léger pipetage pour éviter de créer des bulles.

2. Préparer cocultures MAME

Voir Figure 1 pour un schéma de co-cultures.

1. Placez deux rectangulaires en plastique (des lamelles stérilisées dans l'alcool à 70% pendant 10 min et séché à l'air) dans une boîte de culture de 35 mm ou utiliser un ibiTreat 35 mm μ-vaisselle. Itinéraire ici sont pour les deux lamelles et microéquivalents Plats, que nous utilisons pour étudiantsmeurt sur un microscope droit. Pour les études sur un microscope inversé, nous utilisons uniquement microéquivalents Plats.
2. Mélanger le nombre souhaité de fibroblastes avec DQ-collagène de type I: collagène I matrice. Pour les co-cultures à long terme illustrés dans les figures 2 et 3, nous utilisons 500 fibroblastes dans 10 ul des médias, augmenté de 60 pi de DQ-collagène I: collagène I de la matrice.
3. Utiliser une micropipette de 100 pi, soigneusement la pipette et 70 pi de répandre des fibroblastes: DQ-collagène de type I: matrice de collagène de type I sur toute la surface de chaque lamelle et laisser à 37 ° C dans un incubateur humidifié sans CO ₂ pendant 30 min à se solidifier.
4. Transfert de 35 mm contenant des lamelles plats à 37 ° C avec incubateur 5% de CO ₂ pour 10 min de s'équilibrer.
5. Retirer de l'incubateur et de laisser les plats de 35 mm sous le capot jusqu'à ce qu'ils arrivent à la température ambiante.
6. Ajouter 60 ul de DQ-collagène IV: FrP matrice au sommet de l'solidifié DQ-collagène de type I: matrice de collagène de type I avec des fibroblastes embarqués. Avec la pointe de pipette, carefully répandre DQ-collagène IV: FrP matrice uniforme, en évitant de rayer la fibroblastes: DQ-collagène de type I: collagène I matrice.
7. Transfert de 35 mm contenant des lamelles plats à 37 ° C avec incubateur 5% de CO ₂ pour 10 min à se solidifier. Alors que la IV DQ-collagène: FrP matrice est la solidification, trypsiniser et compter les cellules épithéliales.
8. Placer 50 ul d'une suspension de cellules épithéliales / tumeur sur des lamelles revêtu DQ-collagène IV: FrP matrice. Place de 35 mm plats contenant des lamelles dans un incubateur à 37 ° C. Laisser 40 à 60 min pour les cellules de se fixer à DQ-collagène IV: FrP matrice. Pour les co-cultures à long terme illustrés dans les figures 2 et 3, nous utilisons 2500 cellules épithéliales ou une tumeur.
9. Ajouter 2 ml de milieu de culture contenant FrP 2% à chaque plat de 35 mm. Si vous le faites tous les traitements médicamenteux, les médicaments devraient être ajoutés à ce moment.
10. Incuber pendant la période de temps désirée avant l'imagerie. Pour cultures à long terme, les médias doivent être changés tous les 3-4 jours. Les cellules peuvent être maintenuesdans leur milieu de culture normale. Pour cocultures MAME de lignées de cellules mammaires, nous utilisons épithéliale milieu basal (MEBM-PRF) complémenté avec SingleQuots MEGM.

3. Effectuer 4D (3D + temps) de l'imagerie en direct cocultures MAME par microscopie confocale

1. Pour les études de preuve de principe illustré, cocultures MAME ont été marquées avec un colorant fluorescent suivi de cellules en fonction de notre procédure publiée ^1. Après lavage avec du PBS, cocultures ont été incubées avec 5 Orange CellTracker uM dans un milieu MEGM pendant 45 min dans un incubateur à 37 ° C, lavées à nouveau avec du PBS et incubées avec MEGMmedium préchauffé pendant 30 min à 37 ° C avec 5% de CO ₂ incubateur avant l'imagerie .
2. Image cocultures MAME vivre à un faible grossissement (10X lentille d'eau, trempage) sur un microscope Zeiss LSM 510 META-confocale.
3. Sections optiques sont capturées à des intervalles tout au long de toute la profondeur des structures. Pour nos études, nous capturons des sections optiques à 10intervalles um.
4. Utiliser les sections optiques pour reconstruire des images en 3D. Nous utilisons un logiciel pour générer Volocity reconstructions 3D.
5. Réalisez des films des reconstructions 3D de sorte que les structures, la cellule: les interactions des cellules et les interactions avec les matrices environnantes peuvent être visualisées. Nous avons fait des films avec le lecteur QuikTime 7.

4. Les résultats représentatifs

Le cocultures MAME que nous avons développé sont un modèle souple expérimental pour imagerie des cellules vivantes en temps réel des interactions entre les différents constituants cellulaires qui composent une tumeur du sein et son microenvironnement. Ici, nous démontrons la capacité des modèles de MAME pour récapituler la cellule: les interactions cellulaires au cours de la progression du cancer du sein et de l'imagerie des cellules vivantes pour suivre ces interactions au fil du temps. Nous illustrons la capacité à des interactions d'image entre un préinvasif MCF10.DCIS sein lignée cellulaire humaine et un cancer du sein humain associé à la ligne des fibroblastes, WS-12TI, plus deune période de plus de trois semaines de culture. Le co-cultures ont été imagées à 3, 16 et 23 jours. Sections optiques à travers l'ensemble du volume de la cocultures ont été reconstruits dans les exemples 3D et le représentant sont indiqués pour chacun des trois points dans le temps de la figure 2. La fluorescence rouge dans la figure 2 représente la MCF10.DCIS et WS-12TI cellules. Pour distinguer les deux types de cellules et à long terme cocultures, on peut transfecter ou transduire types cellulaires individuels avec des protéines fluorescentes avant d'établir les cultures. Un co-culture de cellules MAME MCF10.DCIS et WS-12TI qui sont marquées de façon différentielle avec des protéines fluorescentes pour l'identification est illustré à la Figure 3.

En incorporant des substrats, dans ce cas-DQ collagènes, dans le cocultures MAME, nous pouvons évaluer et quantifier les changements au fil du temps dans la protéolyse associée à la transition vers un phénotype invasif. Nous avons établi des méthodes pour quantifier les produits de clivage fluorescents qui résultentà partir de DQ-collagène dégradation ^2,3. On normalise les produits de dégradation dans tout le volume 3D de l'cocultures MAME sur une base par cellule par marquage et de comptage noyaux cellulaires. En outre, on peut localiser la dégradation des compartiments intracellulaires et extracellulaires et de quantifier les produits de dégradation total, intracellulaires et extracellulaires comme nous l'avons décrit précédemment ^2. La fluorescence verte dans les figures 2 et 3 représente des produits de clivage des deux DQ-collagène substrats. A cette époque, les collagènes différentiellement marqués ne sont pas disponibles qui nous permettrait de faire la distinction entre la dégradation de collagène de type IV et de la dégradation du collagène de type.

Les interactions dans le cocultures MAME sont dynamiques et peuvent changer au fil du temps. Pour obtenir de l'information temporelle et dynamique, le même champ de vision peut avoir d'autres sections de représentation et d'optique prises par le spécimen du volume à plusieurs reprises sur une période de temps de quelques minutes à plusieurs semaines,ainsi la collecte des données en 4-D. Dans la figure 2, nous illustrons les changements assez spectaculaires qui se produisent plus de 23 jours: des changements dans le nombre de cellules, la migration cellulaire et les interactions cellulaires, les volumes, les formes de structure structure, les écarts des structures de la sphéricité, les excroissances envahissantes et la protéolyse. En outre, nous avons également démontrer un changement global de volume due à la dégradation de leur cocultures MAME entourant la matrice extracellulaire au cours de cette période. A trois jours comme illustré dans la figure 2A, le volume est 110000 um ^3. En revanche, le volume de la cocultures MAME à 16 et 23 jours est seulement 46250 um ^3, comme illustré dans les figures 2B et C

Figure 1. Schéma de principe de co-cultures de MAME. Lamelle plastique est recouverte de collagène I, contenant DQ-collagène de type I et des fibroblastes (magenta). Une 2ème couche de la membrane basale reconstituée (RBM) contenant DQ-collagen IV est ajouté. Les cellules tumorales (rouge) sont plaqués sur le dessus et FrP 2% dans la culture des médias est superposée (points blancs) à chaque changement de médias. Le vert représente les produits de clivage fluorescentes de DQ-collagène I et IV.

Figure 2. Cocultures de cellules MAME MCF10.DCIS mammaires humaines et WS-12TI fibroblastes mammaires humaines. Les fibroblastes ont été intégrés dans le collagène I / DQ-collagène de type I et recouverte d'FrP contenant DQ-collagène IV. Les cellules ont ensuite été ensemencées CCIS sur le RBM et recouvert d'un milieu contenant 2% FrP. Au cours des 23 jours de coculture illustrés ici, il y avait la prolifération cellulaire, la dégradation de la DQ-collagène IV et I (vert) et des matrices de collagène, comme indiqué par la réduction du volume de la cocultures. Les cellules ont été localisés par l'étiquetage avec Orange CellTracker in situ avant d'imagerie (rouge). Les cocultures mêmes vivants ont été observés au cours des 23 jours avec des images capturées par cmicroscopie onfocal à 3, 16 et 23 jours de coculture. Les tranches optiques résultant ont été reconstruites en 3D avec le logiciel Volocity. Grossissement, 10X.

Figure 3. Cocultures MAME jour 16 de cellules mammaires humaines et MCF10.DCIS WS-12TI fibroblastes mammaires humaines qui expriment DP (rouge) et la YFP (blanc), respectivement. Cocultures ont été établies et analysées comme dans la figure 2. Les deux types de cellules présentées ici ont, cependant, été marqués de façon différentielle afin qu'ils puissent être distingués les uns des autres. Les images agrandies plus élevés dans ce chiffre, par rapport à celles de la figure 2, illustrent la protéolyse de la DQ-collagène IV à la surface des cellules CCIS et la protéolyse diffuse de DQ-collagène de type I dans les zones proches des fibroblastes. Grossissement, 20X.

Discussion

Comme l'a démontré, le co-cultures de MAME peut être utilisé pour imagerie des cellules vivantes en temps réel des interactions entre les différents constituants cellulaires qui composent une tumeur du sein et son microenvironnement. Dans les études en cours dans notre laboratoire, nous avons utilisé cocultures MAME pour identifier les voies protéolytiques associés à la transition à partir d'un CCIS carcinome canalaire invasif, ainsi que les interactions entre les voies protéolytiques et d'autres voies impli...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif / Equipement	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Membrane basale reconstituée (Cultrex)	Trevigen	3445-005-01	Comparable à Matrigel (BD Biosciences)
Collagène de type I	Laboratoires de cohésion	5005-B
DQ-substrats (Collagène de type I, IV)	Invitrogen	DQ-col I-D12060 DQ IV-col D12052
22-mm lamelles en plastique	Fisher Scientific Co.	12-547	Couper en deux, laisser dans l'éthanol à 70% pendant 10 min et sécher à l'air avant de l'utiliser.
Milieu de culture cellulaire	Lonza	MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136	Le rouge de phénol libre
ibiTreat μ-vaisselle	Ibidi	80136
Logiciel Volocity	Perkin-Elmer	Version 5.5	Les autres marques de logiciels d'imagerie peut être utilisée pour générer des reconstructions 3D et les films.