我们开发了三维共培养模型，可用于实时活细胞成像，以观察乳腺肿瘤细胞与其微环境中其他细胞之间的相互作用，这些相互作用影响着向侵袭性表型的进展。这些模型可作为临床前筛选工具，用于靶向筛选影响侵袭性的旁分泌诱导的蛋白水解、趋化因子/细胞因子及激酶通路的药物。
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摘要
摘要
我们开发了三维共培养模型，称之为MAME（mammary architecture and microenvironment engineering，乳腺结构与微环境工程），并将其用于实时活细胞成像，以观察细胞与细胞之间的相互作用。我们的总体目标是构建能够模拟乳腺癌前病变结构的模型，用于研究其向侵袭性表型发展的过程。具体而言，我们构建了用于分析癌前乳腺上皮细胞亚型与其他肿瘤微环境细胞类型之间相互作用的模型，这些细胞类型已被证实可促进或抑制癌前乳腺上皮细胞向浸润性导管癌的进展。迄今研究的其他细胞类型包括肌上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞以及血液和淋巴微血管内皮细胞。除了旨在模拟乳腺癌进展过程中乳腺内细胞相互作用的MAME模型外，我们还开发了用于研究前列腺癌进展的类似模型。
在此，我们展示了建立三维共培养体系的操作流程，以及利用活细胞成像和功能性蛋白水解检测方法，追踪乳腺导管癌共培养体系转变过程的技术细节。 原位 （DCIS）细胞和成纤维细胞随时间推移转变为侵袭性表型，本实验中在培养23天后观察该过程。MAME共培养体系包含多个层次：成纤维细胞嵌入Ⅰ型胶原的底层中，其上覆盖一层重建基底膜（rBM），DCIS细胞接种于此层之上，最上层为2% rBM，每次更换培养基时均予以补充。为观察与侵袭表型进展相关的蛋白水解过程，我们采用荧光淬灭标记的（DQ）荧光基质蛋白（将DQ-Ⅰ型胶原混入Ⅰ型胶原层，DQ-Ⅳ型胶原混入中间rBM层），并通过共聚焦显微镜对活体培养物进行成像。利用Volocity三维可视化软件采集、处理并重建光学切片。在MAME共培养的23天过程中，DCIS细胞增殖并聚集成较大的侵袭性结构，成纤维细胞迁移并整合至这些侵袭性结构中。荧光标记的胶原蛋白水解片段可见于DCIS结构表面、细胞内以及周围基质中广泛分布。针对蛋白水解、趋化因子/细胞因子及激酶通路的药物干预，或共培养体系中细胞组成的改变，均可降低其侵袭性，提示MAME模型可用于新型治疗策略的临床前筛选。
方案
1. 准备 DQ-底物
- 在打开西林瓶前，先让冻干的DQ底物恢复至室温，用去离子水配制1 mg/ml的DQ底物储存液，分装为50 μl每份，于4 °C保存。
可能需要将DQ底物置于超声水浴中振荡约5分钟，并加热至50 °C以促进分散。
- 将rBM置于冰上并在4 °C过夜解冻；rBM在所有操作过程中均应始终置于冰上处理。
- 配制10X磷酸盐缓冲液（PBS）：将80 g NaCl（1.37 M）、2 g KCl（0.027 M）、14.4 g Na2HPO4（1 M）和2.4 g KH2PO4（0.02 M）溶解于800 ml超纯水中。用1.0 M HCl将PBS缓冲液的pH值调节至7.4。定容至1升，经滤膜除菌。
- 在冰上配制I型胶原蛋白溶液：取8份预冷的I型胶原蛋白与1份预冷的10X PBS混合。使用无菌0.1 M NaOH将混合液的pH值调节至7.2–7.6。用pH试纸检测pH值，并用无菌水将最终体积补足至10份。
- 配制DQ-胶原蛋白I：I型胶原基质：在预冷的离心管中，将DQ-胶原蛋白I用I型胶原溶液稀释，使其终浓度分别为25 μg/ml和2.4 mg/ml。
- 配制DQ-胶原蛋白IV：重建基底膜（rBM）基质：在预冷的离心管中，将DQ-胶原蛋白IV用rBM（Cultrex或Matrigel）稀释，使其终浓度分别为25 μg/ml和12–15 mg/ml。在冰上轻轻吹打混匀，避免产生气泡。
2. 准备 MAME 共培养体系
共培养的示意图见图1。
- 将两片矩形塑料盖玻片（在70%乙醇中灭菌10分钟并风干）放入35 mm培养皿中，或使用IbiTreat 35 mm μ-皿。此处的操作说明适用于盖玻片和μ-皿，我们使用这两种装置在直立显微镜上进行研究。对于倒置显微镜上的实验，我们仅使用μ-皿。
- 将所需数量的成纤维细胞与DQ-胶原蛋白I:胶原蛋白I基质混合。对于图2和图3所示的长期共培养实验，我们在10 μl培养基中加入500个成纤维细胞，并与60 μl DQ-胶原蛋白I:胶原蛋白I基质混合。
- 使用100 μl微量移液器，小心地将70 μl成纤维细胞:DQ-胶原蛋白I:胶原蛋白I基质均匀铺展至每片盖玻片的整个表面，然后在37 °C、无CO2的湿润培养箱中放置30分钟使其凝固。
- 将含有盖玻片的35 mm培养皿转移至含5% CO2的37 °C培养箱中，平衡10分钟。
- 从培养箱中取出，将35 mm培养皿置于超净台中，待其恢复至室温。
- 在已凝固并嵌有成纤维细胞的DQ-胶原蛋白I:胶原蛋白I基质上，加入60 μl DQ-胶原蛋白IV:rBM基质。用移液器吸头小心地将DQ-胶原蛋白IV:rBM基质均匀铺开，避免刮伤下方的成纤维细胞:DQ-胶原蛋白I:胶原蛋白I基质。
- 将含有盖玻片的35 mm培养皿转移至含5% CO2的37 °C培养箱中，孵育10分钟使其凝固。在DQ-胶原蛋白IV:rBM基质凝固的同时，进行上皮细胞的胰酶消化和计数。
- 将50 μl上皮细胞/肿瘤细胞悬液接种到涂有DQ-胶原蛋白IV:rBM基质的盖玻片上。将含有盖玻片的35 mm培养皿放入37 °C培养箱中。让细胞贴附于DQ-胶原蛋白IV:rBM基质上，时间为40至60分钟。对于图2和图3所示的长期共培养实验，我们使用2500个上皮细胞或肿瘤细胞。
- 向每个35 mm培养皿中加入2 ml含2% rBM的培养基。若需进行药物处理，应在此时加入药物。
- 在成像前孵育所需时间。对于长期培养，应每隔3–4天更换一次培养基。细胞可维持在其常规培养基中。对于乳腺细胞系的MAME共培养，我们使用添加了MEGM SingleQuots的上皮基础培养基（MEBM-PRF）。
3. 通过共聚焦显微镜对活体MAME共培养物进行4D（3D+时间）成像
- 在本研究所示的概念验证实验中，MAME 共培养物根据我们已发表的方法1用荧光细胞示踪染料进行标记。用 PBS 洗涤后，共培养物在 MEGM 培养基中加入 5 μM CellTracker Orange，于 37 °C 培养箱中孵育 45 分钟，再次用 PBS 洗涤，然后在含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中用预热的 MEGM 培养基继续孵育 30 分钟，随后进行成像。
- 在 Zeiss LSM-510 META 共聚焦显微镜上，使用低倍率（10X，水浸物镜）对活体 MAME 共培养物进行成像。
- 在整个结构深度范围内以一定间隔采集光学切片。在本研究中，我们以 10 μm 的间隔采集光学切片。
- 利用光学切片进行三维图像重建。我们使用 Volocity 软件生成三维重建图像。
- 制作三维重建图像的动态视频，以便观察结构、细胞间相互作用以及细胞与周围基质的相互作用。我们使用 QuickTime Player 7 制作视频。
4. 代表性结果
我们开发的MAME共培养体系是一种可操作的实验模型，可用于实时活细胞成像，以观察构成乳腺肿瘤及其微环境的各种细胞成分之间的相互作用。本文展示了MAME模型在乳腺癌进展过程中重现细胞间相互作用的能力，以及利用活细胞成像技术长期追踪这些相互作用的可行性。我们以人源性乳腺前浸润性细胞系MCF10.DCIS与人源性乳腺癌相关成纤维细胞系WS-12Ti为例，展示了在培养过程中超过三周时间内两者相互作用的成像结果。共培养样本分别在第3、16和23天进行成像。通过对共培养体系的整个体积进行光学切片，并重建为三维图像，图2展示了三个时间点的代表性结果。图2中的红色荧光代表MCF10.DCIS细胞和WS-12Ti细胞。为了区分两种细胞类型并实现长期共培养，可在建立培养体系前将不同细胞类型分别转染或转导表达荧光蛋白。图3展示了一个MAME共培养示例，其中MCF10.DCIS细胞与WS-12Ti细胞被标记了不同的荧光蛋白以便识别。
通过在MAME共培养体系中加入底物（本实验中为DQ-胶原蛋白），我们可以评估并量化与向侵袭性表型转变相关的蛋白水解随时间发生的变化。我们已建立方法，用于定量DQ-胶原蛋白降解所产生的荧光切割产物2,3。通过标记并计数细胞核，我们将MAME共培养体系整个三维体积内的降解产物按每个细胞进行归一化处理。此外，如我们先前所述2，我们能够将降解定位至细胞外和细胞内区室，并分别定量总降解产物、细胞内降解产物和细胞外降解产物。图2和图3中的绿色荧光代表两种DQ-胶原蛋白底物的切割产物。目前尚无不同标记的胶原蛋白可供使用，因此无法区分IV型胶原蛋白与I型胶原蛋白的降解情况。
MAME 共培养体系中的相互作用是动态的，并且会随时间发生变化。为了获取时间序列上的动态信息，可以在数分钟至数周的时间范围内，对同一视野进行反复成像，并对整个样本体积进行连续的光学切片，从而收集四维（4-D）数据。在图 2 中，我们展示了在 23 天内发生的显著变化：细胞数量的变化、细胞迁移与细胞间相互作用、结构体积、结构形态、结构偏离球形的程度、侵袭性突起以及蛋白水解现象。此外，我们还展示了由于 MAME 共培养体系在该时间段内降解其周围细胞外基质所导致的整体体积变化。如图 2A 所示，在第 3 天时，体积为 110,000 μm3；相比之下，如图 2B 和 2C 所示，在第 16 天和第 23 天时，MAME 共培养结构的体积仅为 46,250 μm3。
图 1. MAME 共培养体系的示意图。 塑料盖玻片涂有 I 型胶原蛋白，内含 DQ-I 型胶原蛋白和成纤维细胞（品红色）。加入含有 DQ-IV 型胶原蛋白的重建基底膜（rBM）第二层。将肿瘤细胞（红色）接种于其上，并在每次更换培养基时覆盖含有 2% rBM 的培养基（白色圆点）。绿色代表 DQ-I 型和 IV 型胶原蛋白的荧光切割产物。
图2. MCF10.DCIS人乳腺细胞与WS-12Ti人乳腺成纤维细胞的MAME共培养成纤维细胞被包埋于I型胶原蛋白/DQ-胶原蛋白I中，并覆盖含有DQ-胶原蛋白IV的重组基底膜（rBM）。随后将DCIS细胞接种于rBM上，并覆盖含2% rBM的培养基。在此图所示的23天共培养过程中，观察到细胞增殖、DQ-胶原蛋白IV和I（绿色）以及胶原基质的降解，表现为共培养体系体积的减少。细胞通过CellTracker Orange标记进行定位。 原位 成像前（红色）。相同的活体共培养样本在共培养的第3、16和23天通过共聚焦显微镜进行观察并采集图像。所得光学切片使用Volocity软件重建为三维图像。放大倍数：10X。
图3. MAME 共培养16天的人乳腺MCF10.DCIS细胞与表达RFP（红色）和YFP（白色）的人乳腺成纤维细胞WS-12Ti。共培养的建立与分析方法同图2。但此处显示的两种细胞类型经过差异标记，以便相互区分。与图2相比，本图中更高倍数的图像展示了DCIS细胞表面DQ-胶原蛋白IV的蛋白水解，以及在成纤维细胞附近的区域中DQ-胶原蛋白I的弥散性蛋白水解。放大倍数：20X。
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讨论
如所示，MAME 共培养系统可用于实时活细胞成像，以观察构成乳腺肿瘤及其微环境的各种细胞成分之间的相互作用。在本实验室正在进行的研究中，我们利用 MAME 共培养系统鉴定了与导管原位癌（DCIS）向浸润性导管癌转变相关的蛋白水解通路，以及这些蛋白水解通路与其他参与该转变过程的通路（如趋化因子/细胞因子/生长因子通路）之间的相互作用。我们进一步证明，MAME 模型可作为筛选小分子抑制剂、阻断性抗体或调控蛋白水解/趋化因子/细胞因子/生长因子通路的 shRNA 的有效工具3-5。MAME 模型可用于对肿瘤生长、侵袭和蛋白水解过程进行活细胞成像，观察时间范围可从数分钟至数小时（如我们先前所报道6,7），也可延长至数周，如本文图2和图3所示。所观察到的细胞间相互作用发生在同一物种的细胞之间，即人肿瘤细胞与肿瘤相关细胞之间，而非如活体成像中的人肿瘤细胞与小鼠间质细胞之间的相互作用8。MAME 模型是一种易于操作的实验体系。在共培养前，可利用 shRNA 在特定细胞类型中下调目标分子的表达，从而在三维环境中对这些分子在特定细胞类型中对 DQ-胶原蛋白降解的贡献进行成像和定量分析
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）R01 CA131990 项目（BFS 和 RRM）资助。活细胞成像实验在显微镜、成像与细胞计量资源中心完成，该中心部分由 NIH 中心资助项目 P30 CA22453（资助对象：卡曼诺斯癌症研究所、韦恩州立大学）以及美国国立儿童健康与人类发育研究所围产期研究分部（韦恩州立大学）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 重建基底膜（Cultrex） | Trevigen Inc. | 3445-005-01 | 相当于 Matrigel（BD Biosciences） |
| 胶原蛋白 I 型 | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ 底物（I 型、IV 型胶原蛋白） | Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052 | |
| 22 mm 塑料盖玻片 | Fisher Scientific | 12-547 | 切成两半，使用前在 70% 乙醇中浸泡 10 分钟，然后空气干燥。 |
| 细胞培养基 | Lonza Inc. | MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136 | 无酚红 |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity 软件 | PerkinElmer, Inc. | Version 5.5 | 也可使用其他品牌的成像软件生成三维重建图像和视频。 |
参考文献
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