用于肿瘤的4D活细胞成像的MAME模型：影响恶性进展的微环境相互作用

摘要

我们开发了三维共培养模型，可用于实时活细胞成像，以观察乳腺肿瘤细胞与其微环境中其他细胞之间的相互作用，这些相互作用影响着向侵袭性表型的进展。这些模型可作为临床前筛选工具，用于靶向筛选影响侵袭性的旁分泌诱导的蛋白水解、趋化因子/细胞因子及激酶通路的药物。

摘要

我们开发了三维共培养模型，称之为MAME（mammary architecture and microenvironment engineering，乳腺结构与微环境工程），并将其用于实时活细胞成像，以观察细胞与细胞之间的相互作用。我们的总体目标是构建能够模拟乳腺癌前病变结构的模型，用于研究其向侵袭性表型发展的过程。具体而言，我们构建了用于分析癌前乳腺上皮细胞亚型与其他肿瘤微环境细胞类型之间相互作用的模型，这些细胞类型已被证实可促进或抑制癌前乳腺上皮细胞向浸润性导管癌的进展。迄今研究的其他细胞类型包括肌上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞以及血液和淋巴微血管内皮细胞。除了旨在模拟乳腺癌进展过程中乳腺内细胞相互作用的MAME模型外，我们还开发了用于研究前列腺癌进展的类似模型。

在此，我们展示了建立三维共培养体系的操作流程，以及利用活细胞成像和功能性蛋白水解检测方法，追踪乳腺导管癌共培养体系转变过程的技术细节。 原位 （DCIS）细胞和成纤维细胞随时间推移转变为侵袭性表型，本实验中在培养23天后观察该过程。MAME共培养体系包含多个层次：成纤维细胞嵌入Ⅰ型胶原的底层中，其上覆盖一层重建基底膜（rBM），DCIS细胞接种于此层之上，最上层为2% rBM，每次更换培养基时均予以补充。为观察与侵袭表型进展相关的蛋白水解过程，我们采用荧光淬灭标记的（DQ）荧光基质蛋白（将DQ-Ⅰ型胶原混入Ⅰ型胶原层，DQ-Ⅳ型胶原混入中间rBM层），并通过共聚焦显微镜对活体培养物进行成像。利用Volocity三维可视化软件采集、处理并重建光学切片。在MAME共培养的23天过程中，DCIS细胞增殖并聚集成较大的侵袭性结构，成纤维细胞迁移并整合至这些侵袭性结构中。荧光标记的胶原蛋白水解片段可见于DCIS结构表面、细胞内以及周围基质中广泛分布。针对蛋白水解、趋化因子/细胞因子及激酶通路的药物干预，或共培养体系中细胞组成的改变，均可降低其侵袭性，提示MAME模型可用于新型治疗策略的临床前筛选。

方案

1. 准备 DQ-底物

1. 将冻干的DQ底物瓶恢复至室温后再打开，用去离子水配制1 mg/ml的DQ底物储备液，分装为50 μl每份，4 °C保存。

可能需要将DQ底物置于超声水浴中振荡约5分钟，并加热至50 °C以促进分散。

2. 将rBM置于冰上并在4 °C过夜解冻；rBM在所有操作过程中均应始终置于冰上处理。
3. 配制10X磷酸盐缓冲液（PBS）：将80 g NaCl（1.37 M）、2 g KCl（0.027 M）、14.4 g Na₂HPO₄（1 M）和2.4 g KH₂PO₄（0.02 M）溶解于800 ml超纯水中。用1.0 M HCl将PBS缓冲液的pH值调节至7.4。定容至1升，经滤膜除菌。
4. 在冰上配制I型胶原蛋白溶液：取8份预冷的I型胶原蛋白与1份预冷的10X PBS混合。使用无菌0.1 M NaOH将混合液的pH值调节至7.2–7.6。用pH试纸检测pH值，并用无菌水将最终体积补足至10份。
5. 配制DQ-胶原蛋白I：I型胶原基质，在预冷离心管中将DQ-胶原蛋白I用I型胶原溶液稀释，使其终浓度分别为25 μg/ml和2.4 mg/ml。
6. 配制DQ-胶原蛋白IV：重建基底膜（rBM）基质，在预冷离心管....

讨论

如所示，MAME 共培养系统可用于实时活细胞成像，以观察构成乳腺肿瘤及其微环境的各种细胞成分之间的相互作用。在本实验室正在进行的研究中，我们利用 MAME 共培养系统鉴定了与导管原位癌（DCIS）向浸润性导管癌转变相关的蛋白水解通路，以及这些蛋白水解通路与其他参与该转变过程的通路（如趋化因子/细胞因子/生长因子通路）之间的相互作用。我们进一步证明，MAME 模型可作为筛选小分子抑制剂、阻断性抗体或调控蛋白水解/趋化因子/细胞因子/生长因子通路的 shRNA 的有效工具^3-5。MAME 模型可用于对肿瘤生长、侵袭和蛋白水解过程进行活细胞成像，观察时间范围可从数分钟至数小时（如我们先前所报道^6,7），也可延长至数周，如本文图2和图3所示。所观察到的细胞间相互作用发生在同一物种的细胞之间，即人肿瘤细胞与肿瘤相关细胞之间，而非如活体成像中的人肿瘤细胞与小鼠间质细胞之间的相互作用⁸。MAME 模型是一种易于操作的实验体系。在共培养前，可利用 shRNA 在特定细胞类型中下调目标分子的表达，从而在三维环境中对这些分子在特定细胞类型中对 DQ-胶原蛋白降解的贡献进行成像和定量分析

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重建基底膜（Cultrex）	Trevigen Inc.	3445-005-01	相当于 Matrigel（BD Biosciences）
胶原蛋白 I 型	Cohesion Laboratories	5005-B
DQ 底物（I 型、IV 型胶原蛋白）	Invitrogen	DQ-col I-D12060 DQ-colIVD12052
22 mm 塑料盖玻片	Fisher Scientific	12-547	切成两半，使用前在 70% 乙醇中浸泡 10 分钟，然后空气干燥。
细胞培养基	Lonza Inc.	MEBM-PRFCC-3153 MEGM CC-4136	无酚红
ibiTreat μ-Dish	Ibidi	80136
Volocity 软件	PerkinElmer, Inc.	Version 5.5	也可使用其他品牌的成像软件生成三维重建图像和视频。