Transgene Mäuse sind äußerst nützlich bei der Zuschreibung physiologischen Funktion von Genen. Als solcher Forschung im Allgemeinen und funktionelle Untersuchungen der Atemwege, insbesondere, haben eine bemerkenswerte Verschiebung hin zu Mausmodellen unterzogen. Hier bieten wir Protokolle zur In-vitro- Luftröhre Verengung Studien zur Bewertung der Funktion der glatten Muskulatur in murinen Atemwegen.
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Methodenartikel
In-vitro-Messungen des Tracheal Zusammenziehen mit Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Transgene und Knockout-Mäusen wurden leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der Physiologie und Pathophysiologie der Atemwege 1,2. In-vitro-tensometry von isolierten trachealen Vorbereitungen hat sich als nützlich Assay von glatten Muskelzellen der Atemwege (ASM) kontraktilen Antwort in gentechnisch veränderten Mäusen zu sein. Diese In-vitro tracheale Vorbereitungen sind relativ einfach, bieten eine robuste Antwort, und bewahren Sie sowohl funktionale cholinerge Nervenenden und Muskeln Antworten, auch nach langen Inkubationen.
Tracheale tensometry sowie als funktionelle Assays, um eine Vielzahl von Second-Messenger-Signalwege, die Kontraktion der glatten Muskulatur betreffen studieren. Kontraktion in der Luftröhre ist in erster Linie durch parasympathische, cholinerge Nerven, dass Acetylcholin freisetzen auf ASM (1) vermittelt. Die wichtigsten ASM Acetylcholin-Rezeptoren sind muskarinischen M2 und M3, G i / o und Gq gekoppelten Rezeptoren, die jeweils sind 3,6,7 aktivieren. M2 / G i / o-Signalisierung wird angenommen, dass Kontraktionen durch Hemmung der Adenylatcyclase, was zu einer Abnahme der cAMP-Spiegel 5,8,9,10 erweitern. Diese Wege bilden die so genannten "Pharmako-Kopplung Kontraktion" der glatten Muskulatur der Atemwege 11. Darüber hinaus beinhaltet cholinergen Signalisierung durch M2-Rezeptoren (und moduliert durch M3-Signalisierung) Wege, die die ASM, die wiederum aktivieren L-Typ, spannungsabhängige Kalziumkanäle (Abbildung 1) und Calcium-Einstrom (so genannte "Erregung und Kontraktion" depolarisieren ) 4,7. Detailliertere Bewertungen auf Signalwege steuern Verengung der Atemwege können 4,12 gefunden werden. Die obigen Wege scheinen zwischen Maus und anderen Spezies konserviert werden. Allerdings unterscheiden sich Maus Luftröhre aus anderen Spezies in einige Signalwege. Am bekanntesten ist ihr Mangel an kontraktilen Antwort auf Histamin und Adenosin 13,14, beide bekannte ASM-Modulatoren in Menschen und anderen Spezies 5,15.
Hier stellen wir Protokolle für die Isolierung von murinen Trachealringe und die in vitro-Messung ihrer kontraktilen ausgegeben. Enthalten sind Beschreibungen der Geräte-Konfiguration, Luftröhre Ring Isolation und kontraktilen Messungen. Es werden Beispiele für evozieren Kontraktionen indirekt mit hohem Kalium-Stimulation von Nerven und direkt durch Depolarisation von ASM Muskel zu spannungsabhängigen Calcium-Einstrom aktivieren gegeben (1. Hohe K +, Abbildung 1). Darüber hinaus werden Methoden zur Stimulation von Nerven allein mit elektrischen Feldes Stimulation (2. EFS, Abbildung 1), oder für eine direkte Stimulation der Muskulatur ASM mit exogenen Neurotransmitter, die auf die Badewanne (3. Exogene ACH, Abbildung 1) vorgestellt. Dieses flexibilität und Leichtigkeit der Herstellung macht das isolierte Trachea Ring-Modell eine robuste und funktionelle Assays für eine Vielzahl von Signalwegen in den Atemwegen Kontraktion der glatten Muskulatur beteiligt.
Protokoll
1. Ausrüstung
Die Hauptkomponenten einer Kontraktion Messvorrichtung sind schematisch in 2A gezeigt).
- Ein Bad Gewebe. Das Gewebe Bad unterhält ein sauerstoffreiches physiologischen Lösung bei warmen Temperaturen. Bei Mäusen Trachea Ringe, verwenden wir ein 10 ml Gewebe Bad, das einen Wassermantel enthält zum Zirkulieren eines Erwärmung Lösung, eine Glasfritte Einlaß zu sprudeln Sauerstoff (95% / 5% O 2 / CO 2-Gemisch) und Einlass und Auslassöffnungen zum Ändern Lösungen. Ein Reservoir PSS-Lösung mit konstanter Durchblasen von 95% / 5% O 2 / CO 2-Gemisch
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Diskussion
Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine physiologische Vorbereitung der Atemwege Muskelfunktion zu beurteilen. Wir arbeiten in der Regel 3-4 Organbad Präparate gleichzeitig aber sind vorgefertigte Systeme aus einer Reihe von Anbietern, die simultane Messung von bis zu 8 Zubereitungen (ADInstruments, World Precision Instruments, und Harvard Apparatus) erlauben verfügbar. Wir haben eine Reihe von Kraftaufnehmern und Gewebe Organbäder mit gleichwertigen Ergebnissen genutzt. Allerdings finden wir, dass elektrische Feld .......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Zentrum für Innovation in der Prävention und Behandlung von Atemwegserkrankungen, NINDS Grant (NS052574), und von der Sandler-Programm für Asthma-Forschung finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| Analog-Digital-Wandler | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholin Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10 -2 M in Wasser (Aliquote können bei -20 ° C gelagert werden) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Umwälzthermostat | Haake | Schwingmühle MM400 | |
| Isometrische Kraftaufnehmer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual-Ausgang SquPulse sind Stimulator | |
| Gewebebad | WPI | 47264 |
Referenzen
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N.
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Nachdrucke und Genehmigungen
